[发明专利]一种低成本生产重组人胰岛素原的方法

说明书

本发明提供了一种低成本生产重组人胰岛素的方法，该方法通过基因定向敲除充分释放里氏木霉高产胞外蛋白的能力，提高里氏木霉产重组人胰岛素原的产量，同时充分利用里氏木霉可发酵廉价底物的能力，建立以工农业废弃物为底物的发酵工艺，从而最终降低重组人胰岛素的生产成本。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体公开了一种低成本生产重组人胰岛素原的方法。

背景技术

以随着现代社会饮食与生活方式的转变，以及预期寿命的增加和日益严峻的肥胖问题，糖尿病的发病率呈逐年上升的趋势。

目前在工业生产中，药用胰岛素主要由重组大肠杆菌或重组酵母生产而得。前一种方式是在大肠杆菌中表达胰岛素前体，发酵结束后产物以包涵体的形式存在于大肠杆菌体内，经过破胞、溶解、复性等操作后获得胰岛素(PloS ONE 2016；11:e0167207,生物技术通报2016；32:226-30)，此法产量低、操作繁琐、成本较高；后一种方式是在酵母中(主要是酿酒酵母) 表达胰岛素前体，已折叠成正确构象的成熟胰岛素原被直接分泌到发酵液中，相较于前者，不仅产量更高，而且此法的后续分离纯化更简便，所以成本较低。也正因为如此，世界胰岛素产量的一半来自重组酿酒酵母。

注射胰岛素治疗糖尿病是二十世纪最伟大的医学成就之一，拯救了无数人的生命，但由于糖尿病不能根治，需要终生注射胰岛素，其高昂的治疗费用不仅对于中低收入人群来说是个沉重的经济负担，而且对医疗保障系统来说也是巨大的挑战。目前重组酿酒酵母的胰岛素产量在0.08g/L左右，重组毕赤酵母的胰岛素产量在3g/L左右。因此，降低胰岛素的生产成本以及提高胰岛素的产量变成了当务之急。

发明内容

本发明的目的在于提供一种低成本生产重组人胰岛素原的方法，该方法能够解决现目前重组人胰岛素的产量较低以及成本较高的技术问题。

本发明提供了一种低成本生产重组人胰岛素原的方法，包括如下步骤：构建人胰岛素原异源表达重组载体，将构建好的人胰岛素原异源表达重组载体转入根瘤农杆菌感受态细胞内，得到阳性根瘤农杆菌转化子，将阳性根瘤农杆菌转化子制备成根瘤农杆菌菌液；取里氏木霉Rut-C30制备得到里氏木霉孢子萌发液，将里氏木霉孢子萌发液与根瘤农杆菌菌液混匀后培养2-3d，得到共培菌液，将共培菌液培养5-7d，得到含重组胰岛素原表达盒的潜在里氏木霉转化子；将里氏木霉转化子培养40-50h后，得到里氏木霉转化子T7，选取里氏木霉转化子T7中的阳性转化子即里氏木霉 INS-GFP；将里氏木霉INS-GFP接种于含工农业废弃物的培养基中发酵培养3-7d后，即于培养基内得到重组人胰岛素原。里氏木霉Rut-C30作为重要的工业菌株，广泛用于纤维素酶和其他酶制剂的工业化生产，发酵工艺成熟。该菌种的胞外蛋白浓度可达100g/L以上，同时，该菌种可以直接利用含有纤维素的廉价工农业废弃物作为底物，如乳糖和玉米秸秆。本发明利用该菌株强劲的胞外蛋白分泌能力，异源表达分泌胰岛素原，并利用该菌种可直接利用木质纤维素原料的特性，建立以农业废弃为底物发酵产重组人胰岛素原的方法，对于探寻更低成本的胰岛素生物合成生产工艺具有非常重要的意义。

与现有技术相比，本发明至少具有如下的优点与积极效果：

本发明提供了一种低成本生产重组人胰岛素原的方法，该方法通过基因定向敲除充分释放里氏木霉高产胞外蛋白的能力，提高里氏木霉产重组人胰岛素原的产量，同时充分利用里氏木霉可发酵廉价底物的能力，建立以工农业废弃物为底物的发酵工艺，从而最终降低重组人胰岛素的生产成本。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例提供的一种低成本生产重组人胰岛素原的方法中里氏木霉INS-GFP及其出发菌株的菌丝体显微镜图；