[发明专利]一种用于评估逆转录效率的方法及其应用

权利要求书

1.一种用于评估逆转录效率的方法， 其特征在于，包括如下步骤：

（1）针对目的基因序列设计并体外转录获得RNA；

（2）将步骤（1）的RNA稀释后作为模板进行逆转录数字PCR反应；

（3）通过步骤（2）中的逆转录数字PCR反应的结果计算获得逆转录的模板RNA的拷贝数浓度，并通过步骤（2）中的稀释的倍数计算稀释前的RNA拷贝数浓度为n₁；

（4）采用同位素稀释质谱法检测步骤（1）中的转录RNA的拷贝数浓度为n₂；

（5）计算步骤（2）中所述逆转录的效率为A=n₁/n₂×100%；

所述步骤（4）中同位素稀释质谱法的操作为：

①RNA分子酶切，在酶切体系中加入体外转录的RNA分子及同位素内标；

②配制核苷酸标准溶液；

③液质联用仪分析，将酶切后的RNA分子溶液及核苷酸标准溶液分别经液质联用仪分析，记录每种溶液中四种核苷酸及核苷酸内标的峰面积；

④核苷酸质量浓度,采用如下公式计算：

；

式中：W_x--核苷酸质量浓度，μg/g；

P——核苷酸标准物质纯度，%；

D——稀释倍数；

W_s——样品中同位素内标的质量浓度，μg/g；

I_x——样品中核苷酸与同位素内标的峰面积比；

W₁——高标溶液核苷酸与同位素内标的质量浓度比；

W₂——低标溶液核苷酸与同位素内标的质量浓度比；

I₁——高标溶液核苷酸与同位素内标的峰面积比；

I₂——低标溶液核苷酸与同位素内标的峰面积比;

所述配置核苷酸标准溶液为：利用紫外分光光度法测量体外转录RNA分子溶液的估算浓度，根据分子量及其分子组成估算四种核苷酸的浓度；配制两个浓度的标准溶液，高标溶液及低标溶液，在标准溶液中加入已知纯度的四种核苷酸标准物质，以及四种核苷酸内标，在加入各个组分的过程中，通过天平称量记录各组分的质量；两个标准溶液中，同位素核苷酸内标的浓度均与体外转录RNA分子中核苷酸浓度1：1，高标溶液中，核苷酸浓度大于同位素内标浓度，低标溶液中，核苷酸浓度小于同位素内标浓度。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（1）中RNA浓度为0.1~10 μg/g。

3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，按公式（2）计算RNA分子质量浓度，

（2）

式中：W_RNA--RNA分子质量浓度，μg/g；

M_RNA--RNA分子相对分子质量；

M_NMP——所选核苷酸的相对分子质量；

N--RNA分子中所选核苷酸的数量。

4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，按公式（3）计算RNA拷贝数浓度，

（3）

式中：n₂--RNA分子拷贝数浓度，copies/μL；N_A——阿伏伽德罗常数。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目的基因为新型冠状病毒基因。