[发明专利]一种用于评估逆转录效率的方法及其应用

说明书

本发明提供了一种用于评估逆转录效率的方法。对所建立的或所使用的逆转录‑PCR定量方法的逆转录效率，提出一套基于同位素稀释质谱法的高准确度逆转录效率评估方案。首先通过逆转录数字PCR对目的基因的RNA进行拷贝数浓度的测定，再进一步通过同位素稀释质谱法来测定该目的基因的RNA拷贝数浓度，计算获得的两种RNA拷贝数浓度的比值，从而获得相应的逆转录体系的逆转录效率。通过对逆转录效率准确评估，修正逆转录PCR结果，从而获得目标RNA分子的准确含量，满足不同领域对RNA分子准确定值的需求。

技术领域

本发明涉及基因转录分析领域，具体涉及一种用于评估逆转录效率的方法及其应用。

背景技术

核糖核酸(Ribonucleic acid,RNA)是重要的遗传信息载体，参与蛋白质合成以及基因表达调控等过程。RNA普遍存在于植物、动物、微生物及病毒中。在细胞中，RNA的种类包括信使RNA以及非编码RNA等；而在某些病毒中(如艾滋病毒，新型冠状病毒)，RNA是其唯一的遗传物质。因此，对RNA分子的定性、定量检测，广泛应用于临床检测、微生物检测、转基因检测、法医检测等领域。通常待测样本中RNA含量较低，检测较为困难。基于逆转录以及聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)的方法是目前RNA分子定性、定量检测的最常用方法。PCR技术能够将微量的DNA通过扩增反应使其含量呈指数级增加。因此，通过逆转录反应将RNA分子逆转录为预期序列互补的DNA分子，再通过荧光定量PCR、数字PCR等技术则可以实现RNA分子的定量检测。

逆转录是指在逆转录酶(也称依赖RNA的DNA聚合酶)的催化作用下，以RNA为模板，合成与其序列互补的DNA链的过程。PCR反应能在短时间内在体外通过扩增指数放大特定DNA的含量，但是PCR过程只能以DNA分子为模板进行反应，因此RNA分子必须经过逆转录过程转换成cDNA之后才能采用PCR方法进行定量检测。

逆转录过程是一个酶促反应。逆转录效率指的是将全部RNA分子转化为相应cDNA的比例，这和RNA模板的二级结构以及所用的逆转录酶体系相关。RNA模板GC含量高或二级结构复杂可能会降低逆转录效率。逆转录酶体系包括逆转录酶、dNTP、逆转录引物等成分，其中逆转录酶是最关键的组分。目前市面上主要有莫洛尼鼠白血病病毒MMLV逆转录酶和禽成髓细胞瘤病毒AMV逆转录酶两种，并且多是经过了基因工程改造，使得逆转录酶一方面具有了更高的热稳定性，一些经过基因工程改造的MMLV逆转录酶可以耐受55℃的高温，这种高度耐热的逆转录酶特别适用于从富含GC的RNA模板合成cDNA；另一方面，通过在逆转录酶的RNase H结构域中引入突变，使得逆转录酶所附带的RNase H活性(切割单链RNA，降低cDNA合成效率)降低甚至完全消除，从而提高逆转录效率。因此，以上多种因素造成RNA的逆转录效率并不是恒定的，对于同一种RNA模板，用不同的逆转录酶体系可能得到不同的定量结果(牛春艳，杨佳怡，王晶，李晶，刘文军.逆转录过程对猪繁殖与呼吸综合症病毒定量检测的影响[J/OL].中国动物传染病学报.http://kns.cnki.net/kcms/detail/31.2031.s.20190117.1409.008.html)，其逆转录效率是完全不同的，这造成了在进行RNA定量时，通过逆转录PCR方法得到的只是成功逆转录为cDNA分子的准确含量，原始RNA的含量需要对逆转录效率进行准确评估后才能得到。目前，市场上存在商品化的逆转录试剂盒，包括逆转录酶、引物、缓冲液、dNTPs、RNA酶抑制剂等必要组分，加入客户的目标RNA即可完成逆转录反应，再经过建立的特异性PCR反应方法，即可对RNA分子进行定量检测。但是，对同种目标RNA分子，当使用不同逆转录体系时，可能会得到不同的定量结果。这是由于所使用的逆转录体系不同，逆转录效率不同所造成的。因此，逆转录效率的评估是RNA分子准确定量的关键因素。但是，目前还没有一种直接的、准确的方法能够准确评估RNA逆转录效率。