[发明专利]一种用于检测对硝基酚的试纸条及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种用于检测对硝基酚的试纸条，其特征在于，包括试纸基体，设置在所述试纸基体上的E.coli BL21菌株，所述E.coli BL21菌株携带有pPNP-LacZ质粒，所述pPNP-LacZ质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述pPNP-LacZ质粒的物理图谱如图1所示。

2.根据权利要求1所述的用于检测对硝基酚的试纸条，其特征在于，所述用于检测对硝基酚的试纸条还包括设置在所述试纸基体上的β-半乳糖苷酶显色底物。

3.根据权利要求1所述的用于检测对硝基酚的试纸条，其特征在于，所述β-半乳糖苷酶显色底物选自5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷。

4.根据权利要求3所述的用于检测对硝基酚的试纸条，其特征在于，所述试纸基体为长方形，沿所述试纸基体的长度方向上，所述携带有pPNP-LacZ质粒的E.coli BL21菌株和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷设置在所述试纸基体的1/8～1/2处。

5.根据权利要求4所述的用于检测对硝基酚的试纸条，其特征在于，沿所述试纸基体的长度方向上，所述携带有pPNP-LacZ质粒的E.coli BL21菌株和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷设置在所述试纸基体的1/4处。

6.根据权利要求1所述的用于检测对硝基酚的试纸条，其特征在于，所述试纸基体选自滤纸。

7.一种如权利要求1-6任一项所述的用于检测对硝基酚的试纸条的制备方法，其特征在于，包括步骤：

利用引物聚合酶链反应，从pPNP-mrfp质粒上克隆pPNP基因片段的基因序列，从pCU19质粒上克隆LacZ报告基因片段的基因序列，所述pPNP-mrfp质粒的核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示；

将所述pPNP基因片段的基因序列和所述LacZ报告基因片段的基因序列通过同源重组酶连接，得到连接产物；

将所述连接产物转入到E.coli DH5α感受态细胞中，得到E.coli DH5α/pPNP-LacZ菌种；

将所述E.coli DH5α/pPNP-LacZ菌种接种在含有卡那霉素和对硝基酚的液体培养基中，培养后，收集菌体，然后提取pPNP-LacZ质粒，通过质粒热击转化法，将提取的pPNP-LacZ质粒导入到E.coli BL21菌株中，得到携带有pPNP-LacZ质粒的E.coli BL21菌株，记作E.coli BL21/pPNP-LacZ菌株；

将所述E.coli BL21/pPNP-LacZ菌株接种于含有卡那霉素的液体培养基中，培养后收集，加入到含有乳糖和多粘菌素B的培养基中复苏；

将复苏后的菌株细胞悬液滴加在试纸基体上，在室温下风干后冷冻干燥，得到所述用于检测对硝基酚的试纸条。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，

扩增pPNP基因片段采用的引物：

正向引物序列：GAGATCCGGCTGCTAACAAAGC；

反向引物序列：ATGTATATCTCCTTGCTATTTTCTATTTT；

扩增LacZ报告基因片段采用的引物：

正向引物序列：AAAATAGAAAATAGCAAGGAGATATACATATGACCATGATTACGCCAA；

反向引物序列：GCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCCTATGCGGCATCAGAGCA。

9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，

将所述连接产物转入到E.coli DH5α感受态细胞中，得到E.coli DH5α/pPNP-LacZ菌种，利用引物聚合酶链反应鉴定所述E.coli DH5α/pPNP-LacZ菌种中的pPNP-LacZ质粒；

所述鉴定采用的引物：

正向引物序列：GCAAATGGGTCGCGGATCC；

反向引物序列：GCTTTGTTAGCAGCCGGATCTC。

10.一种如权利要求1-6任一项所述的用于检测对硝基酚的试纸条在检测土壤中可提取态对硝基酚中的应用。