[发明专利]精确定量检测生物医药制品中残留293宿主细胞蛋白的方法及ELISA检测试剂盒

说明书

本发明提供一种精确定量检测生物医药制品中残留293宿主细胞蛋白的方法，其步骤包括：选取目标293宿主细胞，进行培养表达，获取293宿主细胞蛋白；用293宿主细胞蛋白免疫动物，获得抗293宿主细胞蛋白多克隆抗体；利用准确的覆盖率检测方法对纯化后的抗293宿主细胞蛋白多克隆抗体进检测；选择其中覆盖率最高的多克隆抗体，采用ELISA法检测样本中残留的293宿主细胞蛋白。还公开了相应的ELISA检测试剂盒。本发明利用含有高覆盖率的293HCP抗体的ELISA试剂盒来定量检测生物医药制品中残留的293HCP蛋白，检测结果可信度高，效率高，能够同时对多个样本进行检测，检测灵敏度高。

技术领域

本发明专利涉及一种精确定量检测生物医药制品中残留293宿主细胞蛋白的方法及ELISA检测试剂盒。

背景技术

293细胞是人肾上皮细胞系，有多种衍生株，比如HEK293，293T/17等，来源都是人胚胎肾细胞，也常被称作“工具细胞”，实验中常使用它来进行，慢病毒包装生产及滴度测定，细胞转染，条件培养基制作，蛋白表达验证等试验。其在生物制品产业化应用价值优点如下：1)293细胞比较容易转染，是一个很常用的表达研究外源基因的细胞株，多用于瞬时转染表达重组蛋白；2)生长快，生长密度高，转染效率和外源蛋白表达量较高，遗传背景清楚，生理代谢稳定；3)贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养三种方式均可用于293细胞的大规模培养；4)具有很高的质粒转染效率和对保持外源基因的高稳定性；5)对外界微环境较为敏感，可用于药物发现及细胞毒性测试。

293中重组表达生产某些蛋白质，这些蛋白质产品中有许多是用于人类和动物的治疗剂，因此，必须高度提纯。这些产品的制造和纯化过程中，存在来自293宿主细胞蛋白(HCP)杂质的可能性。这些杂质会降低治疗药物的疗效，并导致不良的毒性或免疫反应，因此需要将HCP杂质降至最低水平。

HCP又称宿主细胞蛋白，是生物制品的关键质量属性，影响着生物制品的质量、安全性与有效性。夹心法ELISA检测试剂盒是检测HCP残留的金标准。然而，这种方法高度依赖于试剂盒中HCP抗体对于总宿主细胞蛋白的覆盖率。若ELISA检测中使用的抗体覆盖率不足，可能在最终产品中漏检某些残留的HCP，进而可能在用药患者中引起免疫反应和其他药物安全性问题。美国药典UPS 1132对HCP抗体覆盖率检测提出了新的要求，建议使用2D-SDS-PAGE/Western或DIGE方案对ELISA检测试剂盒中HCP抗体进行覆盖率验证。

本试剂盒采用微量滴度板免疫酶联免疫测定(ELISA)方法。该方法使用的抗体是经过DIGE法检测过的高覆盖率抗体，平台特异性的HCP抗体覆盖率越高，对HCP的定量越准确，因此，本发明是针对293宿主细胞蛋白(HCP)残留进行更加精确的快速评估。

发明内容

本发明的目的是提供一种精确定量检测生物医药制品中残留293宿主细胞蛋白的方法。

一种精确定量检测生物医药制品中残留293宿主细胞蛋白的方法，其特征在于其步骤包括：

(1)选取目标293宿主细胞，进行培养表达，获取293宿主细胞蛋白；

(2)用293宿主细胞蛋白免疫动物，获得抗293宿主细胞蛋白多克隆抗体；

(3)利用准确的覆盖率检测方法对纯化后的抗293宿主细胞蛋白多克隆抗体进检测；

(4)选择其中覆盖率最高的多克隆抗体，采用ELISA法检测样本中残留的293宿主细胞蛋白。

优选的，步骤(1)中所述的目标293宿主细胞为ATCC-CRL-1573、ATCC-ACS-4500、ATCC-CRL-3216。

优选的，步骤(2)中的动物选择家兔。

优选的，步骤(2)中免疫次数为5次，分别为在第0、14、28、42、56天进行，其中最后一次免疫为冲击免疫。