[发明专利]一种可以分泌溶解性多糖单加氧酶的工程菌株及其构建方法与应用

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，具体提供了一种可以分泌溶解性多糖单加氧酶的工程菌株，其特征在于：所述工程菌株为带有用于重组表达溶解性多糖单加氧酶基因Tfu_1665的热纤梭菌工程菌株，溶解性多糖单加氧酶（LPMO）基因Tfu_1665来源于褐色高温双岐菌Thermobifida fusca YX，并通过将该溶解性多糖单加氧酶基因Tfu_1665导入热纤梭菌中，构建了重组表达该基因的热纤梭菌工程菌。所述热纤梭菌工程菌能高效表达溶解性多糖单加氧酶。本发明还公开了该热纤梭菌工程菌株可以高效应用于木质纤维素的水解，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种可以分泌溶解性多糖单加氧酶的工程菌株及其构建方法与应用。

背景技术

木质纤维素是一类分布广泛、数量庞大、处理困难的可再生资源，将其转化成可再生能源具有重要意义。木质纤维素主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，纤维素是一种高度有序、结合紧密的晶体结构，它与半纤维素紧密相连，外周由木质素包围，要将纤维素直接水解成可利用的葡萄糖相当困难。

目前，传统的木质纤维素的酶水解大多使用来源于丝状真菌的纤维素酶，比较典型的有木霉属、曲霉属和青霉属等，但酶解过程中耗酶量高、活性极易受到产物的抑制，且这些酶蛋白不耐高温，不耐酸碱，制约了其大规模应用。

嗜热纤维梭菌是目前自然界中已知的降解纤维素最高效的微生物之一，分泌的纤维小体具有极强的纤维素降解能力。纤维小体降解纤维素的能力大约是木霉属的50倍，这种高效性取决于纤维小体的特殊结构。热纤梭菌本身是一种严格厌氧的嗜热微生物，特殊的生长条件，使得分泌的木质纤维素水解酶具有较好的耐热性、杂菌污染的风险极小。

溶解性多糖单加氧酶（LPMO）是一种全新的木质纤维素降解酶，传统的木质纤维素降解过程主要是在外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、纤维二糖酶等一系列水解酶的作用下，通过打断糖苷键的方式来降解木质纤维素，而溶解性多糖单加氧酶能够通过氧化作用断裂糖苷键产生寡糖链，暴露更多糖苷水解酶结合的位点，从而加快反应进程，提高寡糖或单糖的生成量。有研究表明，达到同样的水解转化率，添加溶解性多糖单加氧酶可以使纤维素酶用量减少一半，因此将溶解性多糖单加氧酶结合热纤梭菌纤维小体应用于木质纤维素酶水解中可以有效提高水解效率。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明提供一种可以分泌溶解性多糖单加氧酶的工程菌株及其构建方法与应用，通过溶解性多糖单加氧酶的协同作用增强了热纤梭菌的酶水解效率，在相同酶解条件下，相比传统的纤维素酶水解，不仅水解时间短，水解率也更高。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明一方面提供了一种可以分泌溶解性多糖单加氧酶的工程菌株，所述工程菌株为带有用于重组表达溶解性多糖单加氧酶基因Tfu_1665的热纤梭菌工程菌株。

所述菌株为将热纤梭菌cel9K基因中SEQ ID No:1所示的核苷酸序列替换为溶解性多糖单加氧酶基因Tfu_1665重组得到的工程菌。

所述溶解性多糖单加氧酶基因Tfu_1665具有如SEQ ID No:2所示的核苷酸序列。

所述溶解性多糖单加氧酶基因Tfu_1665来源于褐色高温双岐菌（Thermobifida fusca YX）。

本发明另一方面提供了一种可以分泌溶解性多糖单加氧酶的工程菌株的构建方法，将溶解性多糖单加氧酶基因Tfu_1665导入热纤梭菌基因组上，构建重组表达该基因的热纤梭菌工程菌，得到可以分泌溶解性多糖单加氧酶的工程菌株。