[发明专利]一种‘秋月梨’愈伤组织的诱导方法及应用方法

权利要求书

1.一种‘秋月梨’愈伤组织的诱导方法，其特征在于包括如下步骤：

步骤S10：采集‘秋月梨’的花蕾，在3~5℃下放置3~5天；

步骤S20：将放置后的所述花蕾清洗和消毒，然后将花蕾中的花药取出，接种到诱导培养基上暗培养30~50天，获得花药愈伤组织，所述诱导培养基为：1/2MS+19~21 g/L蔗糖+1.3~1.7 mg/L 2,4-D+0.8~1.2 mg/L 6-BA+6~8 g/L琼脂，pH 5.8~6.2；

步骤S30：将诱导出的花药愈伤组织接种增殖培养基中进行增殖培养，从而获得愈伤组织，所述增殖培养基为：1/2MS+19~21 g/L蔗糖+0.8~1.2 mg/L 2,4-D+0.8~1.2 mg/L 6-BA+6~8 g/L琼脂，pH 5.8~6.2。

2.如权利要求1所述的‘秋月梨’愈伤组织的诱导方法，其特征在于，所述诱导培养基为1/2MS+20 g/L蔗糖+1.5 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA+7 g/L琼脂，pH 5.8~6.2；所述增殖培养基为1/2MS+20 g/L蔗糖+1.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA+7 g/L琼脂，pH 5.8~6.2。

3.如权利要求1所述的‘秋月梨’愈伤组织的诱导方法，其特征在于，在所述步骤S20中，所述清洗为用无菌水洗3~5遍，去掉花蕾表面的灰尘；所述消毒为使用质量分数75％的酒精浸泡清洗后的花蕾30 s，然后再用质量分数0.1％HgCl₂处理8~10 min，无菌水清洗3~5次后用无菌滤纸吸干花蕾表面水分。

4.如权利要求1所述的‘秋月梨’愈伤组织的诱导方法，其特征在于，在步骤S20中，所述暗培养的温度为25±2℃。

5.如权利要求1所述的‘秋月梨’愈伤组织的诱导方法，其特征在于，在所述步骤S30中，所述增殖培养在暗环境中进行，培养温度为25±2℃，每30~40天进行一次继代。

6.一种‘秋月梨’愈伤组织的应用方法，其特征在于包括如下步骤：

步骤S40：使用携带外源基因的根癌农杆菌转化愈伤组织，然后接种到共培养基中暗培养3天；所述愈伤组织通过如权利要求1至5任一项所述的‘秋月梨’愈伤组织的诱导方法获得，所述共培养培养基为：1/2MS+20 g/L蔗糖+1.0 mg/L 2 ,4-D+1.0 mg/L 6-BA+7 g/L琼脂，pH 5.8~6.2；

步骤S50：步骤S40的暗培养结束后使用脱菌液洗涤2~3次，无菌水洗涤3~5次，在无菌滤纸上吸干水分后转移到筛选培养基中筛选，得到抗性愈伤组织，所述脱菌液为：1/2MS+20g/L蔗糖+300 mg/L头孢霉素。

7.如权利要求6所述的‘秋月梨’愈伤组织的应用方法，其特征在于，所述步骤S40中所述转化的条件为：使用携带外源基因的根癌农杆菌的重悬液浸泡所述愈伤组织并摇晃侵染8~10 min，重悬液中乙酰丁香酮AS工作浓度为200 μmol/L。

8.如权利要求6所述的‘秋月梨’愈伤组织的应用方法，其特征在于，所述步骤S40中所述暗培养的温度为25±2℃。

9.如权利要求6所述的‘秋月梨’愈伤组织的应用方法，其特征在于，所述步骤S50中，所述筛选培养基为：1/2MS+20 g/L蔗糖+7 g/L琼脂+1.0 mg/L2 ,4-D+1.0 mg/L 6-BA+300mg/L头孢霉素+6 mg/L潮霉素。