[发明专利]一种‘秋月梨’愈伤组织的诱导方法及应用方法

说明书

本发明公开了一种‘秋月梨’愈伤组织的诱导方法，首先采集‘秋月梨’的花蕾，然后将花蕾中的花药取出，接种到诱导培养基上暗培养30~50天，获得花药愈伤组织，将诱导出的花药愈伤组织接种增殖培养基中进行增殖培养，从而获得愈伤组织。本发明还公开了所得愈伤组织的应用方法，首先使用携带外源基因的根癌农杆菌转化愈伤组织，然后接种到共培养基中暗培养3天；暗培养结束后洗涤，在无菌滤纸上吸干水分后转移到筛选培养基中筛选，得到抗性愈伤组织。该方法采用‘秋月梨’的花药为外植体在特定培养基中进行诱导和增殖，顺利得到了‘秋月梨’的花药愈伤组织，并经遗传转化获得了抗性愈伤组织。

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种‘秋月梨’花药愈伤的诱导方法及应用。

背景技术

‘秋月梨’为蔷薇科梨属栽培品种，是用162-29（新高×丰水）×幸水杂交育成的中晚熟褐色砂梨新品种。‘秋月梨’抗寒力强，耐干旱；果实略呈扁形，果形端正，果皮黄褐色，果肉乳白色，果核小，可食率95%以上。其肉质细脆，汁多味甜，清香爽口，石细胞极少，品质极优，具有研究价值。同时，在植物分子遗传研究中，构建愈伤组织再生系统相较于其他再生方式，试材更易于接受外源基因、转化率高、扩繁量大。但是在获取‘秋月梨’愈伤组织的过程中，发现利用茎、叶等外植体诱导时，会出现褐变现象而难以成功诱导出愈伤组织，因此，针对‘秋月梨’这种新品种，如何获取其愈伤组织以便进行更有效的研究和应用，是本领域急需解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种‘秋月梨’愈伤组织的诱导方法，该方法采用‘秋月梨’的花药为外植体在特定培养基中进行诱导和增殖，顺利得到了‘秋月梨’的花药愈伤组织。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

一种‘秋月梨’愈伤组织的诱导方法，包括如下步骤：

步骤S10：采集‘秋月梨’的花蕾，在3~5℃下放置3~5天；

步骤S20：将放置后的所述花蕾清洗和消毒，然后将花蕾中的花药取出，接种到诱导培养基上暗培养30~50天，获得花药愈伤组织，所述诱导培养基为：1/2MS+19~21 g/L蔗糖+1.3~1.7 mg/L 2,4-D+0.8~1.2 mg/L 6-BA+6~8 g/L琼脂，pH 5.8~6.2；

步骤S30：将诱导出的花药愈伤组织接种增殖培养基中进行增殖培养，从而获得愈伤组织，所述增殖培养基为：1/2MS+19~21 g/L蔗糖+0.8~1.2 mg/L 2,4-D+0.8~1.2 mg/L6-BA+6~8 g/L琼脂，pH 5.8~6.2。

优选的，所述诱导培养基为1/2MS+20 g/L蔗糖+1.5 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA+7 g/L琼脂，pH 5.8~6.2；所述增殖培养基为1/2MS+20 g/L蔗糖+1.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L6-BA+7 g/L琼脂，pH 5.8~6.2。

优选的，在步骤S20中，所述清洗为用无菌水洗3~5遍，去掉花蕾表面的灰尘；所述消毒为使用质量分数75％的酒精浸泡清洗后的花蕾30 s，然后再用质量分数0.1％HgCl₂处理8~10 min，无菌水清洗3~5次后用无菌滤纸吸干花蕾表面水分。

优选的，在步骤S20中，所述暗培养的温度为25±2℃。

优选的，在步骤S30中，所述增殖培养在暗环境中进行，培养温度为25±2℃，每30~40天进行一次继代。

本发明的另一个目的是提供一种‘秋月梨’愈伤的应用方法，以获得抗性愈伤组织，采取如下技术方案：

一种‘秋月梨’愈伤组织的应用方法，包括如下步骤：