[发明专利]一种检测ctDNA的恒温无酶系统的构建及其应用

说明书

本发明公开了一种检测ctDNA的恒温无酶系统的构建及其应用。该恒温无酶系统基于发夹序列H₁、发夹序列H₂和Reporter‑F和Reporter‑Q构成，发夹序列H₁和发夹序列H₂在目标ctDNA的引发下，相互杂交形成稳定的双链DNA复合物(H₁‑H₂)。Reporter‑F与发夹序列H₁的序列D部分互补配对，且配对碱基数大于与Reporter‑Q的配对碱基数。本发明中的恒温无酶系统对于ctDNA的检测限可以达到7pM，具有较高的信号增益、低背景、较好的选择性和特异性以及较好的血清稳定性，为乳腺癌的早期筛查提供了有效的技术支持。

技术领域

本发明属于基因检测领域，具体涉及一种检测ctDNA的恒温无酶系统的构建及其应用。

背景技术

循环肿瘤DNA(ctDNA)是由肿瘤细胞在凋亡或坏死过程中释放到血液中的基因组片段，携带有肿瘤特异性的遗传学信息。ctDNA通常由90～150个核苷酸构成。ctDNA具有组织特异性，在乳腺癌患者的血清中异常表达。此外，ctDNA在血液中的半衰期较短，一般小于2h，而大多数蛋白生物标志物的半衰期可达数周。因此，ctDNA更能反馈肿瘤的实时状态信息。作为液体活检的有效肿瘤标志物，ctDNA检测可以为乳腺癌的早期诊断和病理分型提供重要的、准确可靠的理论和实验证据。但ctDNA作为肿瘤标志物在乳腺癌患者血清中的丰度很低，对于现有的ctDNA检测带来了一定的困难。因此需要发展一种检测效果更加准确且检测限更低的ctDNA检测方法以用于实际的ctDNA检测中。

相关技术中，用于ctDNA检测的信号扩增方法主要有逆转录聚合酶链式扩增(RT-PCR)、DNA测序和酶辅助的信号扩增。其中，RT-PCR方法操作繁琐，需要严格设计引物并依赖精密的循环温控仪器。DNA测序方法操作耗时，通常需要2-3周，成本比较高。而对于酶辅助的信号扩增，虽然酶辅助的信号扩增中酶的活性比较高，但它需要严格控制酶的活性，操作环境比较苛刻，且制备过程复杂、繁琐，因此其应用受到较大的限制。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种检测ctDNA的恒温无酶系统的构建及其应用。本发明中的用于检测ctDNA的恒温无酶系统检测时间短、操作便捷且灵敏度高，且具有较高的信号增益、低背景、较好的选择性和特异性以及较好的血清稳定性，通过该系统能够有效实现血清中丰度较低的肿瘤标志物ctDNA的高灵敏度检测，从而获得癌症早期诊断的ctDNA表达谱特征，为癌症的早期诊断提供坚实的技术支持。

本发明的第一个方面，提供一种ctDNA检测探针组，该ctDNA检测探针组包括发夹序列组和报告序列组；

所述发夹序列组包括发夹序列H₁和发夹序列H₂；

所述发夹序列H₁包括序列A，序列B，序列C和序列D；

所述序列A和序列B靶向结合目标ctDNA；

所述发夹序列H₂包括序列E和序列F；所述序列E与所述序列B和序列C互补配对，且序列C的碱基数大于序列A的碱基数；

所述发夹序列H₁和发夹序列H₂在目标ctDNA的引发下，相互杂交形成稳定的双链DNA复合物(H₁-H₂)；

所述报告序列组包括Reporter-F和Reporter-Q；

所述Reporter-F与Reporter-Q互补配对；

所述Reporter-F与所述序列D互补配对，且配对碱基数大于与Reporter-Q的配对碱基数。