[发明专利]一种基于pH-stat结合Caco-2模型测定甘油三酯生物可及性的方法

权利要求书

1.一种基于pH-stat结合Caco-2模型测定甘油三酯生物可及性的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1，在37℃水浴条件下，将甘油三酯在模拟唾液中消化5 min，得到口腔消化产物，甘油三酯和唾液的质量体积比为10-200：1，单位mg/mL；

步骤2，按照体积比为1:2，将口腔消化产物在模拟胃液中37℃下消化2 h，得到胃消化产物；

步骤3，按照体积比为1:1，将所述胃消化产物在模拟肠液中37℃下消化，得到肠道消化产物；

步骤4，将所述甘油三酯肠道消化产物加入到Caco-2细胞模型肠腔室中，将新鲜的细胞培养液加入到基底室，经细胞转化后，将得到的细胞培养液离心，收集上清液测定甘油三酯含量，计算甘油三酯的生物可给性。

2.根据权利要求1所述的基于pH-stat结合Caco-2模型测定甘油三酯生物可及性的方法，其特征在于，步骤1中所述的模拟唾液配方为0.89 g氯化钾，0.3 g氯化钠，0.88 g磷酸二氢钠，1.69 g碳酸氢钠，290 mg淀粉酶和25 mg黏蛋白用蒸馏水溶解后定容至500 mL，调节pH为6.8。

3.根据权利要求1所述的基于pH-stat结合Caco-2模型测定甘油三酯生物可及性的方法，其特征在于，步骤2中所述的模拟胃液配方为0.89 g氯化钾，13 g氯化钠，0.25 g磷酸二氢钠，0.65 g葡萄糖，1 g牛血清蛋白、25 mg黏蛋白和2.5 g胃蛋白酶用蒸馏水溶解后定容至500 mL，调节pH为1.3。

4.根据权利要求1所述的基于pH-stat结合Caco-2模型测定甘油三酯生物可及性的方法，其特征在于，步骤3中所述的模拟肠液配方为0.56 g氯化钾，7 g氯化钠，3.38 g碳酸氢钠，1 g牛血清蛋白、30 g胆汁盐，2.25 g胰酶和1.5 g脂肪酶用蒸馏水溶解后定容至1L，调节pH为8.1。

5.根据权利要求1所述的基于pH-stat结合Caco-2模型测定甘油三酯生物可及性的方法，其特征在于，步骤3中所述的模拟肠液的体外消化步骤为：使用电位滴定仪维持pH至6.5，使用0.01-0.1M NaOH滴定，整个消化过程温度控制在37℃，记录NaOH溶液用量用于计算甘油三酯的消化率。

6.根据权利要求1所述的基于pH-stat结合Caco-2模型测定甘油三酯生物可及性的方法，其特征在于，步骤4所述的Caco-2细胞模型模拟小肠吸收的步骤为：在肠道消化液中加入200 μL无水乙醇使乳脂培养液充分混匀，按（1:20）：1摩尔比的比例加入牛血清蛋白作为载体吸附脂质，使用HBSS将消化液稀释至100-1000 μM，在肠腔室中加入甘油三酯消化液，基底侧加入HBSS缓冲液，再转入培养箱中转运12 h，培养结束后基底侧的甘油三酯即为可被肠道吸收的组分。

7.根据权利要求1所述的基于pH-stat结合Caco-2模型测定甘油三酯生物可及性的方法，其特征在于，步骤4中所述的Caco-2细胞培养方案为：将Caco-2细胞置于DMEM高糖培养基中培养，培养基的成分包含8%-20%的胎牛血清、1%的双抗和非必需氨基酸，细胞在25 cm²的培养瓶中培养，将培养瓶放置于37 ℃、5%的CO₂培养箱中，2天换一次液，当细胞生长至覆盖瓶底60%-80%，加入EDTA-胰蛋白酶消化，按照1：3的比例进行传代。

8.根据权利要求1所述的基于pH-stat结合Caco-2模型测定甘油三酯生物可及性的方法，其特征在于，所述的Caco-2细胞模型建立的步骤为：当Caco-2细胞生长至对数期，使用EDTA-胰蛋白酶进行消化，并用培养基制成细胞悬液；将细胞稀释至（0.5-10）×10⁵个细胞/mL，并接种于6孔Transwell小室，然后将Transwell小室置于37 ℃、5%的CO₂中培养箱中，培养14-21d直至细胞完全分化。