[发明专利]一种利用果蝇确定癫痫致病基因的方法

权利要求书

1.一种利用果蝇确定癫痫致病基因的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)收集患者三人组全外显子测序结果和临床资料，分析癫痫患者的候选致病基因；

2)确定癫痫致病基因在果蝇上的同源基因；

3)基于GAL4/UAS转基因系统建立RNAi果蝇敲低(knockdown)模型；

4)揭示拟研究癫痫候选基因对果蝇癫痫行为学和运动能力的影响；

5)采用免疫荧光和in vivo tagging技术，观察拟研究癫痫候选基因编码蛋白在果蝇全脑的表达情况，观察拟研究癫痫候选基因所编码的蛋白在果蝇全脑的空间分布及拟研究癫痫候选基因功能缺失对果蝇全脑结构形态的影响；

6)利用电生理全细胞记录技术研究癫痫候选基因对果蝇中枢神经系统兴奋/抑制平衡的影响。

2.如权利要求1所述的一种利用果蝇确定癫痫致病基因的方法，其特征在于，所述步骤1)中，对考虑遗传性癫痫的患者及其父母开展三人组全外显子测序，初步筛选出潜在癫痫致病基因，若在临床上出现loss of function突变的基因，则可用果蝇的RNAi敲低模型进行下一步行为学验证和机制研究。

3.如权利要求1所述的一种利用果蝇确定癫痫致病基因的方法，其特征在于，所述步骤2)中，从Uniprot数据库中寻找潜在癫痫致病基因在果蝇上的同源基因，若果蝇上对应的同源基因，再将该基因放入果蝇数据库flybase以及国内外各大果蝇中心中查找相应的UAS-RNAi品系。

4.如权利要求1所述的一种利用果蝇确定癫痫致病基因的方法，其特征在于，所述步骤3)中，首先利用果蝇GAL4/UAS系统，把拟研究基因的RNAi特异性地表达在果蝇全体细胞(tub-Gal4)和全体神经细胞(elav-Gal4)，以观察拟研究癫痫候选基因分别在神经元和非神经元表达降低对果蝇行为学和电生理学的影响，初步判断拟研究癫痫候选基因的功能缺失会否直接导致癫痫，并且初步确定拟研究癫痫候选基因的功能是通过在神经元上的表达发挥作用还是通过非神经元细胞发挥作用。

5.如权利要求1所述的一种利用果蝇确定癫痫致病基因的方法，其特征在于，所述步骤4)中，运用Bang-sensitive paralytics试验确定拟研究癫痫候选基因功能缺失是否能诱导果蝇出现癫痫行为，同时利用Heat test，Tapping test进一步研究拟研究癫痫候选基因缺失所致的癫痫发作特点，由于癫痫通常伴随有行动能力障碍，再利用背地趋向试验(negative geotaxis assay)测试突变体的运动能力变化，行为学上的结果有助于确定下一步需要重点关注的大脑区域和与行为相关的分子。

6.如权利要求1所述的一种利用果蝇确定癫痫致病基因的方法，其特征在于，所述步骤5)中，免疫荧光方法研究为：将抗体标记果蝇的拟研究癫痫候选基因所编码的蛋白，再利用激光共聚焦显微镜逐层扫描果蝇全脑，得到拟研究癫痫候选基因所编码的蛋白在果蝇全脑的3D表达谱。

7.如权利要求1所述的一种利用果蝇确定癫痫致病基因的方法，其特征在于，所述步骤5)中，In vivo tagging方法研究为：为避免抗体特异性的问题，利用基于CRISPR的in vivotagging方法，构建带有GFP标记的拟研究基因编码蛋白的基因修饰果蝇，再通过激光共聚焦显微镜逐层扫描观察拟研究癫痫候选基因所编码的蛋白在果蝇全脑的表达。