[发明专利]一种利用果蝇确定癫痫致病基因的方法

说明书

本发明公开了一种利用果蝇确定癫痫致病基因的方法，包括以下步骤：1)收集患者三人组全外显子测序结果及其临床资料，分析癫痫患者的突变基因；2)确定癫痫致病基因在果蝇上的同源基因；3)基于GAL4/UAS转基因系统建立RNAi的果蝇敲低(knockdown)模型；4)揭示拟研究的癫痫基因RNAi模型对果蝇癫痫行为学和运动能力的影响；5)采用免疫荧光和in vivo tagging技术，观察拟研究基因编码蛋白在果蝇全脑的表达情况，观察拟研究基因编码蛋白在果蝇全脑的空间分布及基因功能缺失对果蝇全脑形态的影响；6)研究拟研究癫痫基因对果蝇中枢神经系统兴奋/抑制平衡的影响。本发明通过利用果蝇模型对癫痫病人中已发现的突变基因进行功能和致病性研究，有助于明确癫痫的致病机制。

技术领域

本发明涉及医疗技术领域，具体为一种利用果蝇确定癫痫致病基因的方法。

背景技术

癫痫是一种由脑部神经元高度同步化异常放电引发短暂性脑功能障碍的慢性疾病。据统计全世界癫痫的患病率可高达6.4‰，在神经系统疾病中仅次于脑血管病。尤其是在青少年儿童中癫痫的发病率相当高，不仅对儿童身心健康造成相当大的危害，也给家庭和社会带来极大的经济负担，而至今仍有约1/3的癫痫患者对现行大部分的癫痫药物不敏感，现行癫痫药物缺乏针对性药物治疗效果不佳的一个重要原因，而癫痫的发生发作机制可涉及不同基因的单独或共同参与，复杂的致病因素，使得阐明其机制困难，难以进行后续设计针对性药物予以治疗。

癫痫有一定的遗传倾向，随着全外显子测序在临床上的应用越来越广泛，越来越多的基因突变被发现与癫痫的发生相关。当中包括较为经典的离子通道相关基因，编码神经递质受体基因，离子转运体，酶促代谢途径、信号传导途径/膜结构与物质转运等相关基因。因此，癫痫的发生发作机制可涉及不同基因的单独或共同参与。复杂的致病因素，使得阐明其机制成为一项具有挑战性的工作。通过对癫痫病人中已发现的突变基因进行功能和致病性研究，有助于明确癫痫的致病机制。

发明内容

针对上述存在的技术不足，本发明的目的是提供一种利用果蝇确定癫痫致病基因的方法，全面认识癫痫的发病机制，发现新的药物靶点。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种利用果蝇确定癫痫致病基因的方法，包括以下步骤：

1)收集患者三人组全外显子测序结果和临床资料，分析癫痫患者的候选致病基因；

2)确定癫痫致病基因在果蝇上的同源基因；

3)基于GAL4/UAS转基因系统建立RNAi果蝇敲低(knockdown)模型；

4)揭示拟研究癫痫候选基因对果蝇癫痫行为学和运动能力的影响；

5)采用免疫荧光和in vivo tagging技术，观察拟研究癫痫候选基因编码蛋白在果蝇全脑的表达情况，观察拟研究癫痫候选基因所编码的蛋白在果蝇全脑的空间分布及拟研究癫痫候选基因功能缺失对果蝇全脑结构形态的影响；

6)利用电生理全细胞记录技术研究癫痫候选基因对果蝇中枢神经系统兴奋/抑制平衡的影响。

优选的，所述步骤1)中，对考虑遗传性癫痫的患者及其父母开展三人组全外显子测序，初步筛选出潜在癫痫致病基因，若在临床上出现loss of function突变的基因，则可用果蝇的RNAi敲低模型进行下一步行为学验证和机制研究。

优选的，所述步骤2)中，从Uniprot数据库中寻找潜在癫痫致病基因在果蝇上的同源基因，若果蝇上对应的同源基因，再将该基因放入果蝇数据库flybase以及国内外各大果蝇中心中查找相应的UAS-RNAi品系。