[发明专利]一种HBB融合基因修饰的自体造血干细胞、制备方法及其应用

说明书

本发明提供一种HBB融合基因修饰的自体造血干细胞、制备方法及其应用，属于遗传工程技术领域，所述HBB融合基因由以下模块依次串联得到：DNase I超敏位点HS2、DNase I超敏位点HS3、DNase I超敏位点HS4、启动子、增强子、HSb T88Q；所述HBB融合基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。本发明利用核苷酸优化后的HBB融合基因修饰的CD34⁺细胞，分泌的人结合珠蛋白量更高，红系集落数量更多。

技术领域

本申请涉及一种HBB融合基因修饰的自体造血干细胞、制备方法及其应用，属于遗传工程技术领域。

背景技术

镰状细胞病(SCD)和β-地中海贫血(β-TM)是世界上最常见的单基因疾病，每年约有40万孕妇或新生儿受到影响。这些疾病为两类不同的β-珠蛋白基因突变，导致出现异常的血红蛋白结构(SCD)或β-珠蛋白链(β-TM)大量减少或缺失。这类遗传性疾病的临床表现通常出现在出生后几个月，此时基因表达从胎儿γ-珠蛋白链转换到形成成人βA-珠蛋白链(HbA)。

如果有人类白细胞抗原(HLA)匹配的同胞供者，同种异体造血干细胞移植(AHSCT)目前被推荐作为β-TM的治疗选择。AHSCT后无病生存率在儿童受试者中约为88%，成人为65%。然而，只有不到25%的患者有合适的家族内供体。尽管移植结果正在改善，但AHSCT仍存在严重不良事件和死亡率的重大风险，两者均随受者年龄和疾病严重程度而增加。严重的不良事件包括移植物衰竭、移植物抗宿主病(GVHD)、清除骨髓和免疫抑制的调节方案的早期或晚期副作用(感染、出血、继发性恶性肿瘤)，以及先前存在的器官损害的加重。

对于缺乏合适的hla匹配供体的患者，使用自体造血干细胞进行体外基因治疗为潜在的治疗选择带来了希望。基因治疗，通过体外慢病毒将治疗性β-珠蛋白基因衍生物转染到造血干细胞，使红细胞特异性高表达，使我们有望治愈这种遗传性疾病。

CN110582305A为美国蓝鸟生物公司的发明专利，主要提供了表达正常血红蛋白的基因治疗载体，其中缺乏HS4 DNase I超敏位点，血红蛋白的表达量较低。

CN111447954A专利中主要是对于腺病毒载体的优化，使其具有安全性和有效性。但该专利中HBB基因中的核苷酸点突变或缺失选自264位或265位C的缺失等其他突变，血红蛋白的表达量较低。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明提供一种HBB融合基因修饰的自体造血干细胞、制备方法及其应用，实现以下发明目的：提高人结合珠蛋白的表达量，提高红系集落数量。

为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：

一种HBB融合基因修饰的自体造血干细胞，所述HBB融合基因由以下模块依次串联得到：DNase I超敏位点HS2、DNase I超敏位点HS3、DNase I超敏位点HS4、启动子、增强子、HSb T88Q；

所述DNase I超敏位点HS2的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示；

所述DNase I超敏位点HS3的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示；

所述DNase I超敏位点HS4的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示；

所述启动子的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.5所示；

所述增强子的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.6所示；

所述HSb T88Q的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.7所示。

以下是对上述技术方案的进一步改进：

所述自体造血干细胞为CD34⁺细胞。

所述制备方法包括重组表达载体pCDH-HBB的构建、慢病毒的包装、重组慢病毒感染CD34⁺细胞。