[发明专利]一种固相多酶偶联制备第二信使分子2’3’-cGAMP的方法

权利要求书

1.一种固相多酶偶联制备第二信使分子2’3’-cGAMP的方法，其特征在于，包括步骤如下：

（1）以鼠源核苷转移酶cGAS基因为模板进行PCR扩增，得到tNmcGAS基因序列；然后将tNmcGAS基因序列插入至载体质粒pET28a-SUMO中，得到pET28a-Sumo-mcGAS重组质粒；

（2）将金黄色葡萄球菌鸟苷酸激酶GMK基因插入至载体质粒pET28a中，得到pET28a-GMK重组质粒；

（3）将大肠杆菌核苷二磷酸激酶NDK基因插入至载体质粒pET28a中，得到pET28a-NDK重组质粒；

（4）将步骤（1）~（3）得到的pET28a-Sumo-mcGAS重组质粒、pET28a-GMK重组质粒和pET28a-NDK重组质粒分别转化至大肠杆菌感受态细胞中，验证并挑选阳性重组子，得到重组菌mcGAS、重组菌GMK和重组菌NDK；

（5）分别培养重组菌mcGAS、重组菌GMK和重组菌NDK，经诱导、裂解和离心后，分别得到重组菌mcGAS、重组菌GMK和重组菌NDK的上清液；然后将上清液分别固定至树脂上，得到cGAS固定化树脂、GMK固定化树脂和NDK固定化树脂；

其中，所述树脂为Ni或Co螯合的凝胶树脂；所述上清液和树脂的体积比为1000：（1.5~5）；所述固定的条件为4℃，25~35min；

（6）以ATP和GMP为底物，在cGAS固定化树脂、GMK固定化树脂和NDK固定化树脂下共孵育10~15h，将孵育产物进行分离纯化后，得到第二信使分子2’3’-cGAMP。

2.如权利要求1所述的固相多酶偶联制备第二信使分子2’3’-cGAMP的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述鼠源核苷转移酶cGAS基因的NCBI编号为NP_775562，所述tNmcGAS基因为鼠源核苷转移酶cGAS基因中编码第147~507位氨基酸的核苷酸序列。

3.如权利要求1所述的固相多酶偶联制备第二信使分子2’3’-cGAMP的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述金黄色葡萄球菌鸟苷酸激酶GMK基因的NCBI编号为WP_000368227.1。

4.如权利要求1所述的固相多酶偶联制备第二信使分子2’3’-cGAMP的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述大肠杆菌核苷二磷酸激酶NDK基因的NCBI编号为WP_001696558.1。

5.如权利要求1所述的固相多酶偶联制备第二信使分子2’3’-cGAMP的方法，其特征在于，步骤（6）中，所述ATP、GMP、cGAS固定化树脂、GMK固定化树脂和NDK固定化树脂的摩尔浓度比为8000：2000：（0.1~1）：（0.5~1.5）：（1.5~2.5）。

6.如权利要求1所述的固相多酶偶联制备第二信使分子2’3’-cGAMP的方法，其特征在于，步骤（6）中，所述孵育条件为20~30℃，5~10rpm。