[发明专利]一种固相多酶偶联制备第二信使分子2’3’-cGAMP的方法

说明书

本发明涉及一种固相多酶偶联制备第二信使分子2’3’‑cGAMP的方法。包括构建重组菌mcGAS、重组菌GMK和重组菌NDK，制备cGAS固定化树脂、GMK固定化树脂和NDK固定化树脂，再通过固相多酶偶联制备第二信使分子2’3’‑cGAMP。本发明通过鼠源核苷转移酶cGAS，金黄色葡萄球菌鸟苷酸激酶GMK和大肠杆菌核苷二磷酸激酶NDK多酶偶联反应高效合成了2’3’‑cGAMP，产量达到了179.8mg，总产率达到了41.2％，仅仅使用ATP和GMP作为底物，在不需要额外添加外源DNA就实现了2’3’‑cGAMP的大规模生产，有效地降低了2’3’‑cGAMP的成本。

技术领域

本发明涉及一种固相多酶偶联制备第二信使分子2’3’-cGAMP的方法，属于生物化学与基因工程技术领域。

背景技术

2’3’-cGAMP（2’3’-cyclic guanosine monophosphate-adenosinemonophosphate）是哺乳动物天然免疫通路中重要的第二信使，现广泛用于各种研究领域，如生物学、药学、和临床研究。近来研究显示2’3’-cGAMP有望成为人类抵抗病毒的疫苗佐剂，甚至是癌症的新一代免疫疗法药物。

利用多酶偶联法合成生物小分子已是一种常规技术方案，已广泛用于氨基酸、核酸等化合物的生物合成。同时，固定化酶具有易于与反应物分离、可反复使用等优点，在酶工程中也得到广泛使用。cGAS-STING通路是天然免疫系统的重要组成，cGAS是胞质dsDNA识别受体，识别dsDNA后被活化，催化ATP和GTP合成cGAMP以启动先天和适应性免疫等功能，对机体抗病毒免疫，抗肿瘤免疫以及一些自身免疫病的发生都有重要作用。但是现在还没有利用多酶偶联法合成2’3’-cGAMP的相关报道。

目前，在国内外，2’3’-cGAMP的制备都主要通过酶合成和化学合成等两方法制备。其中酶法合成需要较贵的GTP和大量双链DNA，即增加原材料成本又增加纯化成本。化学合成后续的纯化步骤繁琐，并且不利于环境保护。由于以上原因，导致2’3’-cGAMP的产量低，成本本高达7000元/mg，非常昂贵。因此，探索2’3’-cGAMP的高效，经济，简单的制备方法是有必要，且具有重要的现实意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种固相多酶偶联制备第二信使分子2’3’-cGAMP的方法。

本发明的技术方案如下：

一种固相多酶偶联制备第二信使分子2’3’-cGAMP的方法，包括步骤如下：

（1）以鼠源核苷转移酶cGAS基因为模板进行PCR扩增，得到tNmcGAS基因序列；然后将tNmcGAS基因序列插入至载体质粒pET28a-SUMO中，得到pET28a-Sumo-mcGAS重组质粒；

（2）将金黄色葡萄球菌鸟苷酸激酶GMK基因插入至载体质粒pET28a中，得到pET28a-GMK重组质粒；

（3）将大肠杆菌核苷二磷酸激酶NDK基因插入至载体质粒pET28a中，得到pET28a-NDK重组质粒；

（4）将步骤（1）~（3）得到的pET28a-Sumo-mcGAS重组质粒、pET28a-GMK重组质粒和pET28a-NDK重组质粒分别转化至大肠杆菌感受态细胞中，验证并挑选阳性重组子，得到重组菌mcGAS、重组菌GMK和重组菌NDK；

（5）分别培养重组菌mcGAS、重组菌GMK和重组菌NDK，经诱导、裂解和离心后，分别得到重组菌mcGAS、重组菌GMK和重组菌NDK的上清液；然后将上清液分别固定至树脂上，得到cGAS固定化树脂、GMK固定化树脂和NDK固定化树脂；

（6）以ATP和GMP为底物，在cGAS固定化树脂、GMK固定化树脂和NDK固定化树脂下共孵育10~15h，将孵育产物进行分离纯化后，得到第二信使分子2’3’-cGAMP。