[发明专利]一种霍利迪连接体解离酶DrRuvC及其编码基因和应用

说明书

本发明公开一种霍利迪连接体解离酶DrRuvC及其编码基因和应用。DrRuvC来源于耐辐射奇球菌，在溶液中呈同源二聚体状态，可以特异性结合霍利迪连接体DNA，并在连接处对称地造成单链磷酸二酯键断裂，从而将一个霍利迪连接体解离成两条带有缺口的双链DNA。其特异识别的霍利迪连接体在连接结区域含有保守序列5’‑TC‑3’，酶切位点为胞嘧啶之后的磷酸二酯键。该酶偏爱5’‑(G/C)TC(G/C)‑3’序列，最佳催化金属离子为Mn²⁺(2.5‑10mM)，最适反应pH在7.6‑8.4之间，最适反应NaCl浓度在50‑150mM之间，最适反应温度在40‑45℃之间。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种霍利迪连接体解离酶DrRuvC及其编码基因和应用，具体是一种来源于耐辐射奇球菌的新型霍利迪连接体解离酶(DrRuvC)的制备，并涉及该酶所识别的霍利迪连接体DNA保守序列特征及酶活性提高的方法。

背景技术

霍利迪连接体(Holliday junction resolvase)出现于细胞DNA同源重组(homologous recombination)后期以及DNA复制叉回退(DNA replication forkregression)过程中，其主要结构是一个富含同源区域的四链DNA中间体。基因组中的霍利迪连接体若不能有效解离，将引起基因组复制的紊乱，因此，细胞中常常编码一个或者多个霍利迪连接体解离酶帮助维持基因组的稳定性和细胞分裂的有序性。

研究人员在几年前已发现，大肠杆菌中由ruvC基因编码的蛋白——EcRuvC，具备霍利迪连接体解离酶活性(Saito,A.et al(1995).Identification of four acidicamino acids that constitute the catalytic center of the RuvC Hollidayjunction resolvase.Proc Natl Acad Sci U S A92(16):7470-7474)。EcRuvC是一个同源二聚体结构，其偏好识别的霍利迪连接体在连接结区域含有保守序列5’-(A/T)TT(G/C)-3’。EcRuvC可对称地在霍利迪连接体连接结上打断单链区域的磷酸二酯键(具体为第二个胸腺嘧啶之后的磷酸二酯键)，从而将一个霍利迪连接体解离成两条带有缺口的双链DNA。

目前已经商品化的霍利迪连接体解离酶多为体外表达的重组型大肠杆菌EcRuvC蛋白，例如abcam公司出售的重组型EcRuvC蛋白(货号P0A814)。由于EcRuvC偏好解离含有5’-(A/T)TT(G/C)-3’的霍利迪连接体，对含有其他序列的霍利迪连接体解离能力较弱，因此，其作为基因工程中的工具酶，在使用上存在局限性。

发明内容

本发明的目的是提供了一种新型的来源于耐辐射奇球菌的霍利迪连接体解离酶(DrRuvC)及其编码基因和应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：从耐辐射奇球菌基因组里扩增编码DrRuvC的基因片段、构建DrRuvC表达载体、制备DrRuvC蛋白、DrRuvC蛋白酶活的验证、DrRuvC蛋白最佳底物序列的筛选、DrRuvC最佳酶活条件的摸索(最适金属离子及浓度、最适pH、最适NaCl浓度、最适温度)。

第一方面，本发明提供霍利迪连接体解离酶DrRuvC，其氨基酸序列见SEQ NO.4。

第二方面，本发明提供编码霍利迪连接体解离酶DrRuvC的基因，其核苷酸序列见SEQ NO.3。

第三方面，本发明提供含有DrRuvC编码基因的表达载体。

第四方面，本发明提供酶DrRuvC在解离连接结处含有5’-(G/C)TC(G/C)-3’序列的霍利迪连接体上的应用。