[发明专利]一种电性功能化石墨烯电镜载网的制备方法

说明书

本发明公开了一种不同电性功能化石墨烯电镜载网的制备方法，涉及用带有不同电性的官能团对石墨烯膜进行功能化并转移到电镜载网上的方法，其包括石墨烯膜与重氮盐反应的步骤、铺烃类混合物的步骤、石墨烯膜转移到电镜载网的步骤和去除烃类混合物的步骤。本发明制备的功能化石墨烯电镜载网能够保持石墨烯作为电镜载网支撑膜背景噪音更低的优势，支撑膜对样品具有富集作用，生物大分子不会分布到气液界面变形，同时还能解决优势取向问题。本发明提供的不同电性功能化的石墨烯膜能够给冷冻电镜的制样以及后期三维重构带来极大便利。

技术领域

本发明涉及不同电性功能化石墨烯电镜载网的制备方法，将单层石墨烯膜修饰上不同电荷的基团，并制备修饰石墨烯支撑膜覆盖的电镜载网，用以改变蛋白质颗粒的优势取向问题，属于生物冷冻电镜技术领域。

背景技术

冷冻电子显微镜技术发展至今，已经成为结构生物学研究不可或缺的手段。单颗粒分析是目前应用冷冻电镜技术进行生物大分子结构解析的主流手段。单颗粒分析基于分子结构同一性的假设，利用生物分子的随机分布，对多个不同取向的图像进行统计分析和重构，主要过程包括样品制备、透射电子显微镜成像、图像处理和结构解析等四步。经过近40年发展，尤其是近10年来以直接电子探测相机为代表的各种显微镜硬件设施和结构解析算法不断更新换代，冷冻电镜技术特别是单颗粒分析技术，在显微镜成像、图像处理和结构解析三个步骤已经取得了突飞猛进的发展。但是极为关键的第一步高分辨冷冻样品制备却30多年来几乎没有改变，至今仍然采用的是1984年Jacques Dubochet发明的将生物样品速冻于玻璃态冰中的方法和装置。

冷冻电镜样品制备依赖一个极为关键的耗材——电镜载网。生物样品溶液需要滴加到电镜载网上，再速冻到液态乙烷中变成玻璃态的冷冻样品，以方便后续转移、储存和电子成像。电镜载网通常采用铜或金作为骨架，在上面覆盖一层薄的支撑膜制成。支撑膜的类型和材质直接关系到样品在载网上的状态，从而很大程度上决定生物分子的最终分辨率。长久以来冷冻电镜载网普遍采用多孔碳膜或连续超薄碳膜作为支撑膜，多孔无定形碳膜的原理是让样品悬浮在孔中，对样品的浓度有较高的要求，在滤纸夹吸的过程中会浪费大量样品，还经常出现样品倾向于附着在气液界面导致变性、蛋白不进孔和蛋白在孔中存在优势取向的问题；同时，电子束照射产生的样品漂移问题也比较严重。连续超薄碳膜利用碳膜对样品的吸附作用，是低浓度样品的常用选择，但是超薄碳膜表面性质不均匀、成像背景噪音大、导电性不高、机械强度和延展性也不够强，小于100KDa的蛋白在超薄碳膜上几乎不可见。因此，传统冷冻样品制备会面临制出来的样品重复性、通用性以及均一性差的问题，需要花费大量劳力和物力在优化样品纯化、数据收集和三维重构上。

为了改善这些问题，近年来，科学家开始探索一些新型材料来作为载网支撑膜，其中石墨烯被认为是可以应用于冷冻电镜载网支撑膜比较理想的材料。作为一种超薄的二维材料，石墨烯膜凭借其高度透明性、高度导电性和良好的机械强度融合了多孔碳膜和连续碳膜的优势，能够不同程度上消除目前电镜载网存在的背景噪音强、导电性差、生物分子分布在气液界面以及样品在电子束照射下漂移等问题，但是样品在支撑膜上取向单一的问题难以解决，该问题已经成为制约单颗粒分析高分辨率结构解析的主要瓶颈。

发明内容

发明要解决的问题

由于目前支持膜的缺陷，冷冻样品制备已经成为限制生物结构突破原子分辨率的瓶颈。石墨烯作为一种更稳定、导电性更高、背景噪音更低的新型载网支持膜目前还未被广泛应用，主要原因在于单晶石墨烯的制备工艺复杂，转移困难，转移后污染物难以去除干净以及功能化修饰流程繁琐耗时，难以避免对石墨烯膜的破坏。

本发明的目的是在石墨烯膜上修饰上不同电性的基团，对石墨烯膜进行功能化改性，利用石墨烯作为载网支撑膜的优势，同时解决生物分子在膜上的优势取向问题。