[发明专利]一种根据切点值精确筛选不同大小脂肪细胞的方法

说明书

本发明公开了一种根据切点值精确筛选不同大小脂肪细胞的方法，通过选样、消化、过滤、洗涤、离心、去除脂质层洗涤层、根据切点值选择滤网筛选等步骤，实现脂肪细胞大小的精确筛选。本发明在分析肥胖与非酒精性脂肪肝的疾病关系中，根据脂肪细胞直径的切点，将脂肪组织消化得到的脂肪细胞按细胞大小精确分离，为后续研究脂肪细胞大小对于NAFLD的影响提供进一步的技术支持。

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种根据切点值精确筛选不同大小脂肪细胞的方法。

背景技术

近年来，随着高热量饮食的流行和现代生活方式的改变，全球非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)的患病率迅速增加。脂肪肝的发生和进展受到许多肝外组织的调控，如脂肪组织，肠道和中枢神经系统等。其中，肥胖状态下脂肪组织的形态学改变与脂肪肝的发生及进展密切相关。而在肥胖进展过程中，可以通过脂肪细胞大小的增加和脂肪细胞数量增多来驱动脂肪组织的扩张。肥大的脂肪细胞可以通过增加脂肪因子分泌及基础脂解率来促进肝脏脂质堆积。

内脏网膜脂肪细胞是一种具有储存脂质以及分泌多种脂肪因子的细胞，因其内部脂滴可以储存和容纳大量的脂质，故而其形态可以发生数十乃至数百倍的变化。有少量研究表明内脏脂肪细胞大小在代谢疾病中的不利作用。目前，在研究肥胖与非酒精性脂肪肝疾病关系中，都是通过脂肪细胞悬浮法粗略地分离出相对大和相对小的脂肪细胞，尚未构建出分离并精确确定内脏成熟脂肪细胞大小的方法和应用，也就无法进行针对脂肪细胞大小对于NAFLD影响的进一步精确研究。

发明内容

有鉴于此，本发明期望提供一种根据切点值精确筛选不同大小脂肪细胞的方法，将脂肪组织消化得到的脂肪细胞，根据切点值，按照细胞大小精确筛选分离，为后续的基础实验研究提供技术支持。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种根据切点值精确筛选不同大小脂肪细胞的方法，包括以下步骤：

1)筛选符合生物样本供者健康要求的个体进行样本的采集；

这里，需确保生物样本的安全性，排除包括HIV，HBV，HCV以及其它可能的病毒，避免传播传染性疾病的风险。

2)将采集的内脏网膜脂肪组织迅速转移至冰上，以备后续实验；

这里，脂肪组织为减重手术获得，经患者知情同意，实验方案经鼓楼医院研究伦理委员会批准。

3)去除脂肪组织的纤维成分，剪碎后使用消化液消化；

4)过滤，KRHB缓冲液作为洗涤液，使用分液漏斗洗涤，将洗涤后的细胞溶液转移至50ml离心管中；

5)50g离心3min，溶液分3层，从上到下依次为游离脂质、成熟脂肪细胞和洗涤液，使用注射器将离心管中游离脂质和洗涤液完全去除。

6)根据切点值选择滤网，将滤网置于培养皿中，将脂肪细胞轻柔吸出，经滤网过滤，小于滤孔的脂肪细胞转移至培养皿中，再使用洗涤液洗涤滤网上层细胞，将滤网上层大于滤孔的细胞转移至收集管中，以此实现脂肪细胞的大小精确筛选。

进一步地，所述步骤3)中消化条件为37℃消化40min，所述消化液组分包括含钙镁的HBSS、2％BSA、2型胶原酶，所述2型胶原酶浓度为3mg/g。

这里，含钙镁的HBSS为HBSS+CaCl2+MgCl2，货号为GIBCO 14065-49。

进一步地，所述步骤4)中过滤时，使用250μm细胞筛；所述KRHB 缓冲液包括1*KRH、25mM HEPES、2mM glucose、2％BSA，洗涤时，使用1L KRHB缓冲液洗涤3次，使区分包含前体细胞的下层，与漂浮的成熟脂肪细胞分离。