[发明专利]检测血浆中tRF型胃癌分子标记物以及在制备胃癌辅助诊断试剂盒的应用在审
| 申请号： | 202210400613.9 | 申请日： | 2022-04-16 |
| 公开（公告）号： | CN114875146A | 公开（公告）日： | 2022-08-09 |
| 发明（设计）人： | 宋雪梅;郭俊明;谢瑶瑶;张双双;俞秀冲;翁秋燕 | 申请（专利权）人： | 宁波大学 |
| 主分类号： | C12Q1/6886 | 分类号： | C12Q1/6886;C12N15/11;C12Q1/6851 |
| 代理公司： | 宁波诚源专利事务所有限公司 33102 | 代理人： | 徐雪波;叶桂萍 |
| 地址： | 315211 浙*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 检测 血浆 trf 胃癌 分子 标记 以及 制备 辅助 诊断 试剂盒 应用 | ||
1.一种用于胃癌辅助诊断的检测试剂盒，其特征在于：包括用于检测血浆样本中tRF-18-79MP9P04、tRF-30-87R8WP9N1EWJ、tRF-21-V2989UV3B、tRF-33-P4R8YP9LON4VDP的其中一个或是四个联合的试剂，其中：
tRF-18-79MP9P04的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述tRF-18-79MP9P04在胃早癌患者血浆中显著下调；所述引物为：F1：5'-GTCCCTGTTGTGTTTCCGTAG 3'；R1：5'-GGTACCTCCTCTCTTCTCTACT-3'；
tRF-30-87R8WP9N1EWJ的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述tRF-30-87R8WP9N1EWJ在胃早癌患者血浆中显著上调；F2：5'-GTGTCCCTGGTGGTCTAGTGGTT-3'；R2：5'-GGTACCTCCTCTCTTCTCTACT-3'；
tRF-21-V2989UV3B的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述tRF-21-V2989UV3B在胃早癌患者血浆中显著上调；F3：5'-CGTTGGTAGGATGGGGTGTGA-3'；R3：5'-GGTACCTCCTCTCTTCTCTACT-3'；
tRF-33-P4R8YP9LON4VDP的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述RF-33-P4R8YP9LON4VDP在胃早癌患者血浆中显著下调；F4：5'-GCATGGGTGGTTCAGTGGTAGA-3'；R4：5'-GGTACCTCCTCTCTTCTCTACT-3'。
2.根据权利要求1所述的用于胃癌辅助诊断的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括有tRF-18-79MP9P04、tRF-30-87R8WP9N1EWJ、tRF-21-V2989UV3B以及tRF-33-P4R8YP9LON4VDP的逆转录引物序列，其中，
tRF-18-79MP9P04的逆转录序列如SEQ ID No.5所示：5'-GCAGACGAGGGTACCTCCTCTCTTCTCTACTCGTGTCCTACCCTCGTCTGCCCACTA-3'；
tRF-30-87R8WP9N1EWJ的逆转录序列如SEQ ID No.6所示：5'-GCAGACGAGGGTACCTCCTCTCTTCTCTACTCGTGTCCTACCCTCGTCTGCGCCGAA-3'；
tRF-21-V2989UV3B的逆转录序列如SEQ ID No.7所示：5'-GCAGACGAGGGTACCTCCTCTCTTCTCTACTCGTGTCCTACCCTCGTCTGCTACCTA-3'；
tRF-33-P4R8YP9LON4VDP的逆转录序列如SEQ ID No.8所示：5'-ACAGACGAGGGTACCTCCTCTCTTCTCTACTCGTGTCCTACCCTCGTCTGTCAGGCG-3'。
3.根据权利要求1或2所述的用于胃癌辅助诊断的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括有tRF-18-79MP9P04、tRF-30-87R8WP9N1EWJ、tRF-21-V2989UV3B以及tRF-33-P4R8YP9LON4VDP的探针引物序列，其中，
tRF-18-79MP9P04的探针引物序列如SEQ ID No.9所示：5'-FAM-TGTCCTACCCTCGTCTGCCCACTA-TAMRA-3'；
tRF-30-87R8WP9N1EWJ的探针引物序列如SEQ ID No.10所示：5'-FAM-GGATTCGGCGCAGACGAGGGTAGGA-TAMRA-3'；
tRF-21-V2989UV3B的探针引物序列如SEQ ID No.11所示：5'-FAM-AGGTAGCAGACGAGGGTAGGACAC-TAMRA-3'；
tRF-33-P4R8YP9LON4VDP的探针引物序列如SEQ ID No.12所示：5'-FAM-TTCTCGCCTGACAGACGAGGGTAGGA-TAMRA-3'。
4.一种检测血浆中tRF分子标记物的方法，其特征在于，所述tRF分子标记物为权利要求1中所述的tRF-18-79MP9P04、tRF-30-87R8WP9N1EWJ、tRF-21-V2989UV3B以及tRF-33-P4R8YP9LON4VDP，所述的方法包括如下步骤：
(1)采集血液，提取血浆中的总RNA；
(2)将总RNA逆转录成cDNA；
(3)利用tRF-18-79MP9P04、tRF-30-87R8WP9N1EWJ、tRF-21-V2989UV3B以及tRF-33-P4R8YP9LON4VDP的特异性扩增引物对步骤(2)的cDNA溶液进行荧光定量PCR检测，反应结束后检测荧光信号值并设定Y值；
(4)获得每个样品的Cq值，也就是y值，并按所检测tRF对应的标准曲线计算出相应的拷贝数x后，将按照400×10x/3计算每个样品对应1mL血浆时的拷贝数，并进行早期胃癌患者1mL血浆内tRF-18-79MP9P04、tRF-30-87R8WP9N1EWJ、tRF-21-V2989UV3B、tRF-33-P4R8YP9LON4VDP拷贝数的统计学分析。
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