[发明专利]一种呼吸道细菌联合检测装置及其制备方法

权利要求书

1.一种呼吸道细菌联合检测装置的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：

（a）氧化锌-壳聚糖-胶体金制备

1）N-羧乙基壳聚糖的合成：将4.0g壳聚糖加入到含有2.80mL丙烯酸的200mL 水中，在50℃下，持续搅拌2天，反应完成后，在反应混合液中加入1mol/L的 NaOH溶液，调节溶液的pH值至10-12，使其所有的羧酸全部转化为钠盐，将混合溶液倒入到丙酮中进行重沉淀，然后在水溶液中透析，除去未反应的丙烯酸，透析两天后，冷冻干燥得到N-羧乙基壳聚糖；

2）纳米氧化锌颗粒制备：称取1.3225gZnAc₂·2H₂O溶解在20mL的蒸馏水中,缓慢滴加9mL 5mol/L的NaOH溶液，溶液先出现白色浑浊,继续滴加则浑浊完全消失，再加入11mL的蒸馏水，搅拌均匀，然后倒入低压反应釜中，将反应釜放入烘箱中，在170℃下加热12个小时，自然冷却至室温后,得到沉淀后，分别用水和乙醇清洗、离心两次，将沉淀放入烘箱内于60℃烘干备用；

3）N-羧乙基壳聚糖与纳米氧化锌混合溶液的制备：将5.00gN-羧乙基壳聚糖加入到300mL去离子水中，在室温下剧烈搅拌0.5h，充分溶解得到水溶性壳聚糖溶液，将上述水溶性壳聚糖溶液和纳米氧化锌按一定的比例混合，将混合液剧烈搅拌3h，使其混合均匀；

4）胶体金的制备：

将装有95-105ml纯化水的圆底烧瓶放入电热套指定位置加热，接通电热套电源，加热10-12分钟后，待烧瓶中水即沸腾之时、开启转数控制开关，调至350-400rpm，并用注射器缓慢加入1ml 1%氯化金溶液，之后快速加入1%柠檬酸三钠溶液1-2ml，待溶液冷却到室温后，加水称重补足重量；

5）氧化锌-壳聚糖-胶体金制备：以苯二甲醛作为交联剂，在常温下进行交联；交联结束，将所得的氧化锌-壳聚糖-胶体金洗涤，真空干燥20-24h；

（b）氧化锌-壳聚糖-胶体金交联记抗人IgM抗体，取1ml氧化锌-壳聚糖-胶体金悬浮液，超声分散均匀，然后边搅拌边滴加抗体，加入抗体后，反应 1-2min后，再到超声波上超声20-30秒，然后再反应2-3小时，加 BSA进行封闭24小时，封闭好后进行离心，速度为 10000-12000r/min，20-25min，保留离心后的沉淀，待用；

（c）采用胶体金抗体缓冲液分别稀释步骤（b）离心后的沉淀氧化锌-壳聚糖-胶体金抗体，使其分散均匀，分别获得免疫胶体金抗体溶液，分别用免疫胶体金抗体溶液喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫胶体金抗体玻璃纤维膜；

（d）将硝酸纤维素膜用聚多巴胺处理液预处理后，喷点肺炎链球菌抗原、流感嗜血杆菌抗原、金黄色葡萄球菌抗原、肺炎克雷伯杆菌抗原、肺炎支原体抗原、肺炎衣原体抗原作为检测线，喷点羊抗鼠IgG抗体作为质控线，制得免疫硝酸纤维素膜；

（e）将预处理的样品垫、步骤（c）制备的免疫胶体金玻璃纤维膜、步骤（d）制备的免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在塑料板上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳。

2.根据权利要求1所述的一种呼吸道细菌联合检测装置的制备方法，其特征在于：所述步骤（a）氧化锌-壳聚糖-胶体金制备中，1）N-羧乙基壳聚糖的合成，在水溶液中透析时，采用的透析膜截取分子量为 8000-12000g/mol。

3.根据权利要求1所述的一种呼吸道细菌联合检测装置的制备方法，其特征在于：所述步骤（a）氧化锌-壳聚糖-胶体金制备中，2）纳米氧化锌颗粒制备，缓慢滴加9mL 5mol/L的NaOH溶液，该NaOH溶液为新配制的溶液。

4.根据权利要求1所述的一种呼吸道细菌联合检测装置的制备方法，其特征在于：所述步骤（a）氧化锌-壳聚糖-胶体金制备中，3）N-羧乙基壳聚糖与纳米氧化锌混合溶液的制备，所述水溶性壳聚糖溶液和纳米氧化锌的混合比例是，N-羧乙基壳聚糖与氧化锌的质量之比为 100/5、100/8或100/10。

5.根据权利要求1所述的一种呼吸道细菌联合检测装置的制备方法，其特征在于：所述步骤（c）所述的胶体金抗体缓冲液包括：浓度为20mM Tris-HCL液、蔗糖浓度为5%、海藻糖浓度为1%、proclin浓度为1%，BSA浓度为1%，pH为8.5。