[发明专利]一种用于检测单个CAR-T细胞的慢病毒载体拷贝数的方法及其应用

权利要求书

1.一种用于检测单个CAR-T细胞的慢病毒载体拷贝数的方法，其特征在于：包括如下步骤：

S1，以β-globin为内参基因，设计β-globin的qPCR引物和探针，利用β-globin的质粒模板建立标准曲线1；

S2，设计目的基因的引物和探针，利用目的基因的质粒模板建立标准曲线2；

S3，分别使用β-globin和目的基因的qPCR引物对待测样本进行PCR扩增，从标准曲线1上计算出待测样本的β-globin拷贝数，从标准曲线2上计算出待测样品的CAR拷贝数，然后根据公式计算出目的基因相对细胞数的拷贝数；

目的基因相对细胞数的拷贝数计算公式为：

2.如权利要求1所述的一种用于检测单个CAR-T细胞的慢病毒载体拷贝数的方法，其特征在于：所述内参基因β-globin的核苷酸序列如SEQ ID:NO.1所示；所述内参基因β-globin上游引物的核苷酸序列如SEQ ID:NO.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID:NO.3所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID:NO.4所示。

3.如权利要求1所述的一种用于检测单个CAR-T细胞的慢病毒载体拷贝数的方法，其特征在于：所述目的基因元件选自CD30 scFv、WPRE、HIV-1Ψ和RRE中的至少一种。

4.如权利要求3所述的一种用于检测单个CAR-T细胞的慢病毒载体拷贝数的方法，其特征在于：所述目的基因元件选自CD30 scFv和WPRE。

5.如权利要求4所述的一种用于检测单个CAR-T细胞的慢病毒载体拷贝数的方法，其特征在于：所述CD30 scFv的核苷酸序列如SEQ ID:NO.5，所述CD30scFv上游引物的核苷酸序列如SEQ ID:NO.6所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID:NO.7所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID:NO.8所示。

6.如权利要求4所述的一种用于检测单个CAR-T细胞的慢病毒载体拷贝数的方法，其特征在于：所述WPRE的核苷酸序列如SEQ ID:NO.9，所述CD30 scFv上游引物的核苷酸序列如SEQ ID:NO.10所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID:NO.11所示，探针的核苷酸序列如SEQID:NO.12所示。

7.根据权利要求4所述的一种用于检测单个CAR-T细胞的慢病毒载体拷贝数的方法，其特征在于：所述内参基因β-globin、目的基因CD30 scFv和WPRE的探针5’端均标记有荧光基团，3’端均标记有淬灭基团FAM；所述荧光基团选自VIC、FAM、TET、HEX、CY3、CY5、Texas Red、LC RED640和LC RED705中的一种。

8.如权利要求1所述的一种用于检测单个CAR-T细胞的慢病毒载体拷贝数的方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应体系：AceQ qPCR Probe Master Mix15.0μL、PF Primer 20μM1.2μL、PR Primer 20μM 1.2μL、Probe 20μM 0.3μL、Sample 5.0μL、RNase-free Water 7.3μL、Total30μL；PCR扩增的反应条件：95℃，5min；(95℃，10s；60℃，30s；)×45。

9.如权利要求1-8任一所述的一种用于检测单个CAR-T细胞的慢病毒载体拷贝数的方法在检测慢病毒载体拷贝数中的应用，其特征在于：所述慢病毒载体拷贝数为整合入平均每个CAR-T细胞基因组中的慢病毒载体拷贝数。

10.如权利要求1-8任一所述的一种用于检测单个CAR-T细胞的慢病毒载体拷贝数的方法在检测待测样本中CAR拷贝数的应用。