[发明专利]一种用于检测单个CAR-T细胞的慢病毒载体拷贝数的方法及其应用

说明书

本发明提出了一种用于检测单个CAR‑T细胞的慢病毒载体拷贝数的方法，包括如下步骤：S1，以β‑globin为内参基因，设计β‑globin的qPCR引物和探针，利用β‑globin的质粒模板建立标准曲线1；S2，设计目的基因的引物和探针，利用目的基因的质粒模板建立标准曲线2；S3，分别使用β‑globin和目的基因的qPCR引物对待测样本进行PCR扩增，从标准曲线1上计算出待测样本的β‑globin拷贝数，从标准曲线2上计算出待测样品的CAR拷贝数，然后根据公式计算出目的基因相对细胞数的拷贝数。本发明以β‑globin为内源参照基因，能够稳定且有效地检测出整合入CAR‑T细胞基因组中整合的病毒载体拷贝数，且能够换算成平均每个CAR‑T细胞基因组中整合的病毒载体拷贝数。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于检测单个CAR-T细胞的慢病毒载体拷贝数的方法及其应用。

背景技术

CAR-T指嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)T细胞，是指将能识别某种肿瘤抗原的抗体单链可变区(Single chain antibody fragment，Scfv)与胞内信号区在体外偶联为一个嵌合蛋白，通过基因转导的方法转染体外培养的患者T细胞，使其表达嵌合抗原受体(CAR)。这一过程通过重组慢病毒载体进行导入，即外源基因(嵌合抗原受体，CAR)导入到宿主细胞(T细胞)。由于在转导过程中，慢病毒载体被随机插入宿主基因组内，插入的拷贝数和位点都不固定。当外源基因以低拷贝数(1或2个)插入时能较好的表达，而多拷贝数插入的外源基因表达不稳定甚至出现基因沉默现象。因此，测定CAR-T细胞基因组慢病毒载体的拷贝数，可以为CAR-T细胞靶点基因的表达情况提供依据。

现有技术中，拷贝数大多以DNA为单位表示copys，无法精确定量每个细胞内的拷贝数，进而无法评估CAR的单细胞拷贝数对CAR-T细胞的影响。

发明内容

有鉴于此，本发明提出了一种能够精确定量每个细胞内的拷贝数的慢病毒载体拷贝数的方法。

本发明的技术方案是这样实现的：第一方面，本发明提供了一种用于检测单个CAR-T细胞的慢病毒载体拷贝数的方法，包括如下步骤：

S1，以β-globin为内参基因，设计β-globin的qPCR引物和探针，利用β-globin的质粒模板建立标准曲线1；

S2，设计目的基因的引物和探针，利用目的基因的质粒模板建立标准曲线2；

S3，分别使用β-globin和目的基因的qPCR引物对待测样本进行PCR扩增，从标准曲线1上计算出待测样本的β-globin拷贝数，从标准曲线2上计算出待测样品的CAR拷贝数，然后根据公式计算出目的基因相对细胞数的拷贝数；

目的基因相对细胞数的拷贝数计算公式为：

在以上技术方案的基础上，优选的，所述内参基因β-globin的核苷酸序列如SEQID:NO.1所示；所述内参基因β-globin上游引物的核苷酸序列如SEQ ID:NO.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID:NO.3所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID:NO.4所示。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述目的基因元件选自CD30 scFv、WPRE、HIV-1Ψ和RRE中的至少一种。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述目的基因选自CD30 scFv和WPRE。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述CD30 scFv的核苷酸序列如SEQ ID:NO.5，所述CD30 scFv上游引物的核苷酸序列如SEQ ID:NO.6所示，下游引物的核苷酸序列如SEQID:NO.7所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID:NO.8所示。