[发明专利]一株高产麦角甾醇的酿酒酵母工程菌株、构建方法及应用

权利要求书

1.一株高效产麦角甾醇的酿酒酵母工程菌株，其特征在于：所述酿酒酵母工程菌株是在酿酒酵母宿主中过表达SEQ ID NO.1所示的脂质转运蛋白基因SEC14基因构建得到的，脂质转运蛋白基因SEC14的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，其所编码的的氨基酸序列为SEQ IDNO.2。

2.根据权利要求1所述的高效产麦角甾醇的酿酒酵母工程菌株，其特征在于：所述工程菌株在构建时所采用的表达载体为pRS426，所采用的宿主菌为酿酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)BY4741。

3.根据权利要求2所述的高效产麦角甾醇的酿酒酵母工程菌株，其特征在于：所述工程菌株在构建时构建了包含HA-tag的SEC14融合基因。

4.如权利要求1至3任一项所述的酿酒酵母工程菌株的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)将SEQ ID NO.1所示的SEC14基因与HA-tag构建融合基因至表达载体pRS426中；

(2)对构建的表达载体采用醋酸锂转化法转入酿酒酵母BY4741进行表达；

(3)通过尿嘧啶营养缺陷型固体酵母培养基筛选，能够在尿嘧啶营养缺陷型固体培养基上生长出的单菌落，即得到单克隆重组菌株。

5.如权利要求1至3任一项所述的酿酒酵母工程菌株的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)将SEQ ID NO.1所示的SEC14基因与3HA即HA×3构建融合基因；

(2)以质粒pYX212为模板，进行PCR扩增，得到P_TPI1启动子；

(3)将融合基因和P_TPI1启动子与载体pRS426连接，构建含有SEC14基因的重组质粒；

(4)对构建的重组质粒采用醋酸锂转化法导入酿酒酵母BY4741中进行表达；

(5)在尿嘧啶营养缺陷型固体培养基上得到高表达SEC14的BY4741/

pRS426-P_TPI1-SEC14-3HA菌株，即得。

6.如权利要求1至3任一项所述的酿酒酵母工程菌株在生产麦角甾醇中的应用。

7.利用如权利要求1至3任一项所述的酿酒酵母工程菌株发酵生产麦角甾醇的方法，其特征在于：步骤如下：

将酿酒酵母工程菌划线于尿嘧啶营养缺陷型固体培养基平板上，28～30℃培养48-72h，将活化后的菌种，接1-2环于装有3-5mL尿嘧啶营养缺陷型液体培养基的试管中，28～30℃，180-220rpm条件下培养12-16h即为种子培养液，将种子培养液按2-10％接种量接入到尿嘧啶营养缺陷型的发酵培养基中，28～30℃，180-220rpm条件下发酵24-36h，即得。

8.根据权利要求7所述的发酵生产麦角甾醇的方法，其特征在于：所述尿嘧啶营养缺陷型固体培养基为：酵母氮源基础6.5-7g/L，灭菌结束后加入尿嘧啶缺陷型氨基酸混合物0.72-0.84g/L和葡萄糖1.7-2.3％，琼脂2-3％，用ddH₂O定容至1L；

所述尿嘧啶营养缺陷型液体培养基为：酵母氮源基础6.5-7g/L，灭菌结束后加入尿嘧啶缺陷型氨基酸混合物0.72-0.84g/L和葡萄糖1.7-2.3％，用ddH₂O定容至1L；

所述尿嘧啶营养缺陷型发酵培养基为：酵母氮源基础6.5-7g/L，灭菌结束后加入尿嘧啶缺陷型氨基酸混合物0.72-0.84g/L和葡萄糖1.7-2.3％，用ddH₂O定容至1L；

其中，上述百分数均为质量浓度百分数。