[发明专利]一株高产麦角甾醇的酿酒酵母工程菌株、构建方法及应用

说明书

本发明公开一株高效产麦角甾醇的酿酒酵母工程菌株，所述酿酒酵母工程菌株是在酿酒酵母宿主中过表达SEQ ID NO.1所示的脂质转运蛋白基因SEC14基因构建得到的，脂质转运蛋白基因SEC14的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，其所编码的的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。本发明所构建的酿酒酵母工程菌株所含麦角甾醇为酵母菌干重的0.95％‑1.20％，比野生型酵母菌株提高了26％‑31％。本发明提供的工程菌不但具有产量高的优点，并且可以通过相对简单的方法条件进行发酵，在工业上易于实现并控制，投资成本低，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是一株高产麦角甾醇的酿酒酵母工程菌株、构建方法及应用。

背景技术

麦角甾醇，又称麦角固醇，是一种28碳甾族化合物，广泛存在于酵母中，是真菌细胞膜的重要组成成分，对确保细胞活力、膜的流动性、膜结合酶的活性、膜的完整性以及细胞物质运输等起着重要作用。麦角甾醇是一种重要的医药化工原料，用于生产“可的松”、“激素黄体酮”等甾醇类药物。麦角甾醇也是维生素D₂的前体，经紫外线照射后可得到维生素D₂。在医药工业上，维生素D₂是预防和治疗佝偻病、龋齿及老年骨质疏松症的重要药品。维生素D₂还可以作为饲料添加剂添加在饲料中，增加畜禽的产蛋率和孵化率。

目前，国内外用于生产麦角甾醇的酵母菌种主要采用以下四种选育方法获得：自然选育、常规选育、杂交法、原生质体融合法。上述四种技术均存在明显的不足之处。自然选育是从不同酵母菌种进行筛选。研究发现，对不同种、属的酵母菌的麦角甾醇的含量进行分析，不同种、属间差异很多，该方法工作量大且耗时长。常规选育是用诱变剂对菌株进行处理。这种方法可以直接获得高产麦角甾醇的菌株，但诱变选育的随机性大，结果具有不确定性。采用杂交法和原生质体融合法可以将不同菌株的优良性状结合起来，能获得生物量和麦角甾醇含量都较高的菌株。但研究发现，在这些酵母细胞中还含有2wt％左右的麦角甾醇前体物24(28)-脱氢麦角甾醇存在。若24(28)-脱氢麦角甾醇不能进一步转化为麦角甾醇，则酵母细胞内的麦角甾醇含量将不能被有效提升。

我国麦角甾醇年产量不能满足消费者的需求，需要从国外进口，但从总体来看，我国对麦角甾醇的需求量呈逐年上升的趋势。因此，本领域迫切需要开发一种有效提升细胞内麦角甾醇含量的菌株。

通过检索，发现如下两篇与本发明专利申请相关的专利公开文献：

1、一种可动态调控7-脱氧胆固醇及维生素D3的酿酒酵母菌的构建方法及应用(CN113025512A)，所述构建方法包括以下步骤：S1、使用启动子GAL7控制酿酒酵母工程菌种mot3基因的表达，转化入原始酵母菌中构建第一酿酒酵母菌；S2、构建麦角甾醇动态调控的dCas9系统并提取构建的质粒；S3、人工合成融合基因片段gal80F-loxT-PTEF1-DHCR24-Tcyc1-PGAP-DIC-TADH1-gal80R，将其转化进入第一酿酒酵母菌，PCR验证后获得第二酿酒酵母菌；S4、将步骤S3中构建的质粒转化进入第二酿酒酵母菌中，经筛选后获得可动态调控生产7-DHC的酿酒酵母菌。本发明所提供的构建方法构建的酿酒酵母菌，通过在不影响菌株生长状态的同时，利用酿酒酵母内源的甾醇调控系统，结合dCas9系统实现副产物的减少，7-DHC的产量提升。

2、一种产生菜籽甾醇的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用(CN110903993A)，所述酿酒酵母工程菌含有甾醇Δ7-还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因。本发明提供的酿酒酵母工程菌能够将麦角甾醇还原成菜籽甾醇。在本发明中，所述酿酒酵母工程菌中共表达甾醇Δ7-还原酶和葡萄糖脱氢酶，就可以葡萄糖脱氢酶形成的NADPH作为辅因子，利用甾醇Δ7-还原酶将酿酒酵母固有的麦角甾醇还原成菜籽甾醇，从而达到生物制备菜籽甾醇的目的。

通过对比，本发明专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同。

发明内容