[发明专利]用于检测鰤鱼诺卡氏菌核酸的引物、荧光探针和试剂盒

说明书

本发明公开了一种用于检测鰤鱼诺卡氏菌核酸的引物和荧光探针，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物如序列表中SEQ ID NO.1；所述反向引物如序列表中SEQ ID NO.2；所述荧光探针如序列表中SEQ ID NO.3。本发明还公开了所述的用于检测鰤鱼诺卡氏菌核酸的引物和荧光探针的用于检测鰤鱼诺卡氏菌核酸的试剂盒。本发明通过在鰤鱼诺卡氏菌基因组中具有多拷贝的ITS上选择一段保守序列，并针对该序列设计引物和探针，使得该引物和荧光探针具有高特异性及高灵敏度，不仅可以检测无发病症状鱼类体内是否存在鰤鱼诺卡氏菌，也可检测养殖水体鰤鱼诺卡氏菌丰度。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于检测鰤鱼诺卡氏菌核酸的引物组、荧光探针和试剂盒。

背景技术

鰤鱼诺卡氏菌在分类上属于细菌域、厚壁菌门、放线菌纲、放线菌目、诺卡氏菌科、诺卡氏菌属。鰤鱼诺卡氏菌是水产动物的主要致病菌，宿主广泛，可感染多种淡水和海水鱼类，该菌所致的疾病日益严重，对水产养殖产业造成巨大的经济损失，同时也是水产品质量安全隐患产生的重要因素之一。诺卡氏菌病具有潜伏期时间长、早期症状不明显等特点,然而，出现病症时，其内脏组织已出现大量肉芽肿和坏死组织，错失最佳治疗时间。明确养殖环境中病原菌丰度和早期诊断，进行提前预防是防治该病的关键。因此，早期快速检测技术就显得尤为重要和迫切。现有技术中对鰤鱼诺卡氏菌的快速检测方法有聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术、实时荧光定量PCR技术和环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)。

在研究过程中，发明人发现现有技术至少存在以下问题：

目前的实时荧光定量PCR技术只有染料法，虽然该检测技术针对病鱼组织具有特异性，但诺卡氏菌属的细菌广泛存在自然环境中，使得基于染料法实时荧光定量PCR在检测环境中的鰤鱼诺卡氏菌的特异性低，此外，报道的荧光定量PCR技术引物靶标基因为单拷贝，灵敏度不足检微量的鰤鱼诺卡氏菌。而PCR技术灵敏度不足，而高灵敏度的LAMP检测技术易出现假阳性且不可定量，难以应用于早期发病的鱼和养殖环境中病原的检测。

发明内容

为了解决现有技术中检测方法不能检出早期发病的鱼和环境中病原菌的问题，本发明提供一种用于检测早期发病鱼和环境中的鰤鱼诺卡氏菌核酸的引物、荧光探针和试剂盒。

本发明提供了一种用于检测鰤鱼诺卡氏菌核酸的引物和荧光探针，所述引物包括正向引物和反向引物。所述正向引物如序列表中SEQ ID NO.1；所述反向引物如序列表中SEQ ID NO.2；所述荧光探针如序列表中SEQ ID NO.3。

所述荧光探针的5’端和3’端分别用荧光报告基团和淬灭基团修饰，修饰所述5’端的所述荧光报告基团为：FAM、HEX、ROX、Cy3或Cy5，修饰所述3’端淬灭基团为：TAMRA NHS、BHO1、BHO2、BHO3或Eclipse。

另一方面，本发明提供一种用于检测鰤鱼诺卡氏菌核酸的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物和荧光探针。

进一步地，所述试剂盒还包括：PCR反应液、核酸释放试剂、阴性质控品和阳性质控品。

所述PCR反应液包括：无菌水、具有5’→3’外切活性的DNA聚合酶、dNTP、10×PCRBuffer和含Mg离子的溶液。

所述核酸释放试剂包括：无菌水、Triton-X100、NP-40和Tris-HCL。

所述阴性质控品为不含鰤鱼诺卡氏菌的ITS基因的PMT18-T载体质粒DNA。

所述阳性质控品为含有所述鰤鱼诺卡氏菌的ITS基因片段的PMT18-T载体质粒DNA，浓度为50ng/μL。

具体地，所述具有5'→3'外切活性的DNA聚合酶为Taq酶。