[发明专利]一种pSFV-flagX-CMV复制子质粒、制备方法和鸡尾酒混合疫苗

说明书

本发明属于生物工程技术领域，公开了一种pSFV‑flagX‑CMV复制子质粒，采用含塞姆利基森林病毒复制子的载体，并将p54，p22，p32，p72，pCD2v，M448R，MGF505‑7R和M1249L基因分别插入所述载体而得；所述p54，p22，p32，p72，pCD2v，M448R，MGF505‑7R基因序列依次如SEQ ID NO.15‑NO.21所示。该质粒通过插入非洲猪瘟抗原基因(X)，制得的pSFV‑flagX‑CMV复制子质粒在真核细胞能够高效表达ASFV抗原蛋白，有利于非洲猪瘟鸡尾酒DNA疫苗的研制，也有利于通过Flag抗体胶对这些蛋白进行纯化，制取有别于原核表达的，具备翻译后修饰的高质量抗原蛋白；同时，本发明还公开了该质粒的制备方法和鸡尾酒混合疫苗。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种pSFV-flagX-CMV复制子质粒、制备方法和鸡尾酒混合疫苗。

背景技术

非洲猪瘟(ASF)是一种病毒性出血病，对家猪和欧亚野猪的致死率极高。近年该病已从欧洲传播至我国及其周边诸国。迄今对该病仍然缺乏安全和有效的疫苗防控，一经发现只能大规模扑杀，造成不可估量的经济损失和社会影响。尽管多个基因缺陷型活疫苗的研究成果已展示了良好的免疫保护效力，但其保护力仍不完全。尤其是免疫功能低下的动物可因接种此类疫苗成为新的病毒携带者和传播者。为此目前对非瘟活疫苗的使用尚未推广。迄今的研究结果表明，灭活病毒疫苗对该病不能提供保护。蛋白亚单位疫苗因其不能刺激有效的细胞免疫反应，不能有效祛除细胞内的病毒而受到局限。已有研究表明单纯的中和性抗体并不能完全阻止ASFV病毒的复制和扩散。目前的DNA疫苗结果也仅显示部分保护作用。病毒载体疫苗也还处于研发阶段，有可能成为对抗ASFV的武器。

塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus，SFV)复制子DNA是一种能在真核细胞内进行有限自我复制的表达系统。其携带的目的基因能通过载体所携带的复制酶基因产物的作用下进行大量复制，因此具更高的抗原蛋白表达能力。SFV复制子DNA含大量CpG序列，从而具有较强的刺激天然免疫反应的效力。因此基于SFV复制子的DNA疫苗不需要添加任何佐剂就能激发较强的细胞免疫和体液免疫反应。基于SFV的载体己用于抗多种感染性疾病(包括人和畜)的疫苗研究。其中人用疫苗已进入临床前期和临床期(抗癌)。在动物疫苗方面， SFV载体已应用于禽兽疫苗的研发，其中包括猪流感，猪水泡病毒(SVDV)，猪瘟病毒(CSFV) 等猪源病毒的免疫研究，并显示有很好的攻毒保护效力。

非洲猪瘟病毒(ASFV)属双链大DNA病毒，结构非常复杂。病毒粒子结构由内到外分别为核质体、核衣壳、囊膜(分为外层与内层)：核质体主要由病毒基因组、DNA结合蛋白(p10、 p14、p37、p34等)及基因早期转录所需的酶组成；核衣壳主要含有结构蛋白p72和p17，由大约2000个壳粒组成；内侧囊膜来源于宿主的内质网，结合着p12、p22、p32、p54及CD2v 蛋白，外层囊膜为病毒出芽附带产物，松散环绕在四周。ASFV全基因组约为170–190kbp，含151到167个开放阅读框。迄今用质谱和免疫电镜进行蛋白鉴定已发现68种病毒蛋白，其中54种是结构蛋白，23种是病毒粒子的重要组成部分。

本案要解决的技术问题是：如何开发出一种能够让真核细胞能够高效表达ASFV抗原蛋白的质粒，以为开发非洲猪瘟鸡尾酒DNA疫苗做出准备。

发明内容

针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的目的在于提供一种 pSFV-flagX-CMV复制子质粒；该质粒通过插入非洲猪瘟抗原基因(X)，制得的 pSFV-flagX-CMV复制子质粒在真核细胞能够高效表达ASFV抗原蛋白，有利于非洲猪瘟鸡尾酒DNA疫苗的研制，也有利于通过Flag抗体胶对这些蛋白进行纯化，制取有别于原核表达的，具备翻译后修饰的高质量抗原蛋白；同时，本发明还公开了该质粒的制备方法和鸡尾酒混合疫苗。

本发明目的通过以下技术方案实现：