[发明专利]一种海藻糖酶、重组菌及其在酵母制品水解中的应用

说明书

本发明公开了一种海藻糖酶、重组菌及其在酵母制品水解中的应用，本发明的杓兰果胶杆菌，保藏编号为CGMCC No.17442。本发明首次报道了一种产海藻糖酶的杓兰果胶杆菌，海藻糖酶酶活为19U/mL。将该海藻糖酶基因在大肠杆菌体系中异源表达，重组菌在5 L罐发酵28 h达到最高酶活2150 U/mL。重组蛋白PCTre的最适反应温度和pH分别为35°C和5.5，在25‑55°C、pH 5‑8.5条件下均有较好的稳定性，对有机溶剂耐受性好，在10%乙醇溶液中16 h仍能保留70%的酶活。该海藻糖酶水解酵母粉中海藻糖，可在20 min内完全水解，体系中可利用糖比率从1.45%增加到10.31%。

技术领域

本发明涉及一种海藻糖酶、重组菌及其在酵母制品水解中的应用，属于工业微生物技术领域。

背景技术

海藻糖是由两个葡萄糖分子以α,α-1-1糖苷键构成的非还原性糖，性质稳定，能耐受高温。海藻糖酶(Trehalase)可将其水解为葡萄糖，在食品、农业、发酵工业等领域应用广泛。

酵母具有利用糖质原料合成海藻糖的能力，在高浓糖质底物发酵体系中酵母甚至能够合成4％以上的海藻糖，成为发酵液中残糖的主要部分，导致原料利用率下降。为此，杜邦公司在2016年推出Synerxia发酵技术体系，其核心创新是在酶制剂中加入了海藻糖酶，宣称可降低糖耗并增产乙醇2％。随后诺维信公司在2017年也推出了含海藻糖酶的全新淀粉酶产品，其目标是将二糖残留值降低达70％，此举进一步推动了海藻糖酶的应用。然而我国海藻糖酶的研究相对滞后，亟须在海藻糖酶新基因发现、高表达体系以及应用研究方面予以重视，提高产酶水平、降低生成成本、改善催化性能以更好地用于工业生产。

由于在昆虫体内，海藻糖是重要的能量物质，因此海藻糖酶及海藻糖合成酶的研究一直是昆虫代谢机制、昆虫抗逆特性研究的关注点，昆虫海藻糖酶基因位点也被作为农业杀虫剂的新靶点；而在微生态领域，由于海藻糖酶能够破坏生物膜的形成与稳定，也可以作为绿色抑菌剂成分进行使用；此外，在临床医学研究中，发现海藻糖酶的竞争性抑制剂1,5-脱水山梨醇(1,5-AG)是血液中能够反应血糖中长期代谢水平的关键指标，比糖化血红蛋白(HbA1c)更为敏感，因而利用海藻糖酶开发1,5-AG的检测试剂盒也是国际研究中的一个热点，其在临床检测领域潜力巨大。

酵母粉、酵母浸膏、酵母浸粉等酵母制品中通常含有较高的海藻糖，作为培养基用于工程菌发酵时，所含的海藻糖可干扰微生物的代谢，如果在酵母制品生产过程中，采用海藻糖酶将其转化为葡萄糖，不仅能够降低对微生物的影响、使培养过程和产物代谢更为可控，而且可以提高酵母粉的发酵利用效率。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一株产海藻糖酶菌A4，经鉴定为杓兰果胶杆菌(Pectobacterium cypripedii)以及表达海藻糖酶的重组菌株及应用。

本发明的第一个目的是提供一株杓兰果胶杆菌，命名为杓兰果胶杆菌(Pectobacterium cypripedii)，于2019年03月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.17442。

本发明的第二个目的是提供一种海藻糖酶，所述海藻糖酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

本发明的第三个目的是提供一种编码所述的海藻糖酶的基因。

进一步地，所述的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第三个目的是提供一种携带所述基因的表达载体。

本发明的第四个目的是提供一种表达所述的海藻糖酶的重组细胞或重组菌。

进一步地，所述的重组菌以大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母或丝状真菌为宿主。

本发明的第五个目的是提供所述的海藻糖酶、重组细胞或重组菌在水解酵母制品中的应用。