[发明专利]一种鉴定广西涠洲岛豹纹鳃棘鲈原生种的SSR分子标记引物组及其应用

权利要求书

1.一种鉴定广西涠洲岛豹纹鳃棘鲈原生种的SSR分子标记，其特征在于，所述SSR分子标记为PLWZ-01、PLWZ-02、PLWZ-03、PLWZ-04、PLWZ-05、PLWZ-06，其核苷酸序列分别如SEQID NO.1～6所示。

2.一种扩增权利要求1所述SSR分子标记的引物组，其特征在于，所述引物组为：

扩增PLWZ-01的引物序列分别如SEQ ID NO.7～8所示；

扩增PLWZ-02的引物序列分别如SEQ ID NO.9～10所示；

扩增PLWZ-03的引物序列分别如SEQ ID NO.11～12所示；

扩增PLWZ-04的引物序列分别如SEQ ID NO.13～14所示；

扩增PLWZ-05的引物序列分别如SEQ ID NO.15～16所示；

扩增PLWZ-06的引物序列分别如SEQ ID NO.17～18所示。

3.权利要求1所述SSR分子标记或权利要求2所述引物组在鉴定广西涠洲岛豹纹鳃棘鲈原生种或制备鉴定广西涠洲岛豹纹鳃棘鲈原生种的检测试剂盒中的应用。

4.一种鉴定广西涠洲岛豹纹鳃棘鲈原生种的检测试剂盒，其特征在于，含权利要求1所述SSR分子标记或权利要求2所述引物组。

5.一种鉴定广西涠洲岛豹纹鳃棘鲈原生种的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.收集待鉴定豹纹鳃棘鲈群体样本，提取样本DNA；

S2.以步骤S1提取的DNA为模板，分别利用权利要求2中所述引物组进行PCR扩增；

S3.对步骤S2扩增后的PCR产物进行毛细管电泳分型；

S4.对步骤S3获得的分型结果进行峰图判读和构建等位基因矩阵；

S5.通过步骤S4得到的待检测豹纹鳃棘鲈等位基因，与已知广西涠洲岛豹纹鳃棘鲈原生种的等位基因进行比较，计算样品之间的遗传距离；

S6.对步骤S5得到的遗传距离，进行聚类分析，构建聚类树，并通过聚类树判断待检测豹纹鳃棘鲈是否为涠洲岛原生种。

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，步骤S2中PCR扩增的反应体系为：不含Mg²⁺的10×PCR buffer 2.5μL、25mM MgCl₂ 2.0μL、10mM dNTP 0.5μL、高保真PCR酶1U、10μM正向引物0.5μL、10μM反向引物0.5μL、DNA模板12.5ng，其余由无菌双蒸水补足至25μL。

7.根据权利要求5所述方法，其特征在于，步骤S2中PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环；72℃再延伸6分钟。

8.根据权利要求5所述方法，其特征在于，步骤S3中毛细管电泳分型将步骤S2中采用的引物组中的5’端标记FAM荧光基团，并利用ABI 3730XL基因型分型测序仪进行毛细管电泳分型。

9.根据权利要求5所述方法，其特征在于，步骤S5中已知广西涠洲岛豹纹鳃棘鲈原生种的等位基因为：

PLWZ-01位点为：258、261、267；

PLWZ-02位点为：195、279、282、288；

PLWZ-03位点为：238、251、256、279；

PLWZ-04位点为：237、252、255、258；

PLWZ-05位点为：257、272、291；

PLWZ-06位点为：178、199、215、219。

10.权利要求5～9任一所述方法在豹纹鳃棘鲈地理种群或鉴别增殖放流种种苗的原生种亲本中的应用。