[发明专利]用于癌细胞原代培养的添加剂及其培养基和用途

权利要求书

1.一种用于癌细胞原代培养的添加剂，其特征在于，包括霍乱毒素、R-spondin、A-83-01和Y-27632中的至少三种；优选地为霍乱毒素、R-spondin、Y-27632。

2.根据权利要求1所述用于癌细胞原代培养的添加剂，其特征在于，包括霍乱毒素、R-spondin、A-83-01和Y-27632。

3.一种用于癌细胞原代培养的培养基，其特征在于，所述培养基包括权利要求1-2任一项所述用于癌细胞原代培养的添加剂，优选地，所述培养基包含完全DMEM培养基和F12营养混合物，更优选地，所述添加剂包含于所述F12营养混合物中。

4.根据权利要求3所述用于癌细胞原代培养的培养基，其特征在于，所述F12营养混合物还包括氢化可的松、EGF、胰岛素、两性霉素B、庆大霉素。

5.根据权利要求4所述用于癌细胞原代培养的培养基，其特征在于，所述完全DMEM培养基含或者不含有5-10％血清。

6.根据权利要求3所述用于癌细胞原代培养的培养基，其特征在于，所述完全DMEM培养基和所述F12营养混合物的体积比为(2-4)：1。

7.根据权利要求3-6中任一项所述用于癌细胞原代培养的培养基，其特征在于，所述培养基不含有成纤维细胞。

8.一种如权利要求3-7任一项所述用于癌细胞原代培养的培养基在肿瘤药物敏感性筛选中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，具体方法如下：

S1.分离肿瘤组织：

S101.将切除组织标本用乙醇溶液快速冲洗，再用2-5℃PBS溶液冲洗，然后转移到无菌培养皿中；

S102.去除残余脂肪组织；

S103.将新鲜标本切成直径小于10mm的小块，得到组织碎片；

S2.原代细胞培养：

S201.用F培养基稀释10倍浓度胶原酶/透明质酸酶溶液，并将溶液置于管中；

S202.将F培养基/胶原酶/透明质酸酶与分散酶混合；

S203.将步骤S103得到的组织碎片转移到含有F培养基/胶原酶/透明质酸酶/分散酶的管中，并在35-40℃下在摇摆平台上孵育1-3h；

S204.消化完后，将细胞离心并弃去上清液；

S205.将细胞沉淀重悬于权利要求3-7中任一项所述完全DMEM/F12培养基中，将细胞悬液通过100μm细胞过滤器过滤到新的离心管中，将细胞离心并弃去上清液；

S3.药物敏感性测试：

S301.将步骤S205培养好的细胞消化成单细胞悬液，计数，稀释，接种至96孔板，每个孔细胞总数为2000-3000个；

S302.经过10-15h贴壁培养，将待测药物的DMSO溶液加入对应的孔中，每个药物的给药的最高给药浓度为50Um，往下10倍比稀释5个浓度，得到6个给药浓度；

S303.给药后继续培养48-72小时，用荧光法测定细胞活力，计算每个药物的IC₅₀值，

任选地，所述乙醇溶液快速冲洗的时间不超过3s；所述乙醇溶液浓度为95-100％。

10.权利要求1-2任一项所述的添加剂在制备用于癌细胞原代培养的培养基中的用途。