[发明专利]一种降低乌菜小孢子再生植株褐化率的方法

权利要求书

1.一种降低乌菜小孢子再生植株褐化率的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)花序的选择

待乌菜植株现蕾后，摘取花序，备用；

(2)小孢子分离

选取花瓣长度与花药长度之比在0.5～1之间的花蕾，用70％酒精与0.1％HgCl₂进行组合消毒，弃废液后再用无菌水冲洗；接着，在B5培养基中研碎花蕾释放出小孢子，并先后使用钢丝网筛和细胞网筛过滤；再接着，收集滤液于离心管进行离心；离心后，用B5培养基重悬沉淀后再次离心，所得沉淀即为所需的纯化小孢子；

(3)小孢子培养

将纯化小孢子用NLN培养基稀释，并调整细胞密度为1×10⁵～2×10⁵个/mL；接着，将稀释后的纯化小孢子分装到培养皿中，并添加0.5mg/g～4mg/g浓度的类黄酮和5μg/100g～40μg/100g浓度的角黄素；最后，在33℃下热激处理24h后转至25℃下黑暗培养，待出现肉眼可见的胚状体后，置于摇床上振荡培养；

(4)胚状体萌发及成苗

将培养好的子叶期胚状体转移到MS培养基上进行分化培养，直至培养成苗。

2.根据权利要求1所述的降低乌菜小孢子再生植株褐化率的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，选择的花序具体为盛花期无虫害且无裂蕾的植株主花序或一级分支的健康花序。

3.根据权利要求1所述的降低乌菜小孢子再生植株褐化率的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，选择对应花序后，将其置于自封袋中并喷清水，接着置于4℃冰箱中储存1～2天，备用。

4.根据权利要求1所述的降低乌菜小孢子再生植株褐化率的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，对花蕾进行组合消毒的具体方法为：先用70％酒精震荡消毒30s，再用0.1％HgCl₂震荡消毒6min；待组合消毒完成，弃废液，再用无菌水冲洗3次，每次5min。

5.根据权利要求1所述的降低乌菜小孢子再生植株褐化率的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，待选取的花蕾完成消毒与清洗后，用玻璃棒在B5培养基中研碎花蕾释放出小孢子，并先后使用300目钢丝网筛和细胞网筛过滤；再接着，收集滤液于离心管中，并于1000r/min条件下离心5min；离心后，用B5培养基重悬沉淀，并将重悬液于1000r/min条件下再次离心5min，最终所得沉淀即为目标所需的纯化小孢子。

6.根据权利要求1所述的降低乌菜小孢子再生植株褐化率的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，将稀释后的纯化小孢子分装到培养皿中，并添加类黄酮和角黄素时，类黄酮的添加浓度具体为1mg/g，角黄素添加浓度为10μg/100g。

7.根据权利要求1所述的降低乌菜小孢子再生植株褐化率的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，转移到MS培养基上的子叶期胚状体的长度为2.5～3mm。

8.根据权利要求1所述的降低乌菜小孢子再生植株褐化率的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，分化培养的培养条件为：25℃，2000lux光照强度。