[发明专利]一种降低乌菜小孢子再生植株褐化率的方法

说明书

本发明提供了一种降低乌菜小孢子再生植株褐化率的方法，步骤如下：待乌菜植株现蕾后，摘取花序；用酒精与HgCl₂消毒花蕾，并用无菌水冲洗；释放出小孢子，经过滤、离心得纯化小孢子；将小孢子用NLN培养基稀释、分装到培养皿，并添加0.5mg/g～4mg/g类黄酮和5μg/100g～40μg/100g角黄素；最后，热激处理转至黑暗培养，待出现胚状体振荡培养；将培子叶期胚状体转移到MS培养基上分化培养。本发明的优点在于：通过在小孢子培养基中同时添加类黄酮和角黄素这两种成分来有效提高小孢子抗氧化能力，从而使胚胎发育再生植株的褐化率有效降低，为加快乌菜杂交育种速度、提高育种效率和种质创新提供强有力的基础。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种降低乌菜小孢子再生植株褐化率的方法。

背景技术

乌菜(Brassica campesttris L.ssp.chinesis(L.)Makino var.rosularis Tsenet Lee)又名塌菜、塌棵菜、塌地松、黑菜等，为十字花科二年生芸薹属白菜(B.campestrisL.)的一个亚种，是十字花科的两年生草本植物。乌菜原产于我国，富含矿物质和维生素，在秋季播种后经过霜雪，味道甜美，口感最佳，是白菜中的珍品。

小孢子是高等植物雄配子体减数分裂后四分体释放出的单核细胞。游离小孢子培养是指直接从花蕾或花药中获得小孢子群体进行培养的方法。小孢子培养技术已经普遍应用在很多植物中，与传统育种方法相比，通过小孢子培养可快速获得各种纯合基因，因此对由多基因控制的特异性状的筛选能一步到位，大大提高选择机率，加快育种进程。小孢子培养技术还被广泛应用于诱变育种、种质创新、构建群体进行基因定位、作图及遗传分析领域当中。

目前，小孢子的游离培养在多种作物中获得成功，尤其是十字花科蔬菜的研究成绩斐然。然而，迄今为止，小孢子的游离培养在理论和实践中仍然存在一些问题，主要表现在“胚状体再生过程中褐化情况严重”这一方面。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种降低乌菜小孢子再生植株褐化率的方法，其通过在小孢子培养基中同时添加类黄酮和角黄素这两种成分来提高小孢子抗氧化能力，从而使胚胎发育再生植株的褐化率有效降低。

本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：

一种降低乌菜小孢子再生植株褐化率的方法，包括如下步骤：

(1)花序的选择

待乌菜植株现蕾后，摘取花序，备用；

(2)小孢子分离

选取花瓣长度与花药长度之比在0.5～1之间的花蕾，用70％酒精与0.1％HgCl₂进行组合消毒，弃废液后再用无菌水冲洗；接着，在B5培养基中研碎花蕾释放出小孢子，并先后使用钢丝网筛和细胞网筛过滤；再接着，收集滤液于离心管进行离心；离心后，用B5培养基重悬沉淀后再次离心，所得沉淀即为所需的纯化小孢子；

(3)小孢子培养

将纯化小孢子用NLN培养基稀释，并调整细胞密度为1×10⁵～2×10⁵个/mL；接着，将稀释后的纯化小孢子分装到培养皿中，并添加0.5mg/g～4mg/g浓度的类黄酮和5μg/100g～40μg/100g浓度的角黄素；最后，在33℃下热激处理24h后转至25℃下黑暗培养，待出现肉眼可见的胚状体后，置于摇床上振荡培养；

(4)胚状体萌发及成苗

将培养好的子叶期胚状体转移到MS培养基上进行分化培养，直至培养成苗。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中，选择的花序具体为盛花期无虫害且无裂蕾的植株主花序或一级分支的健康花序。