[发明专利]检测粪便中人巨细胞病毒的PCR引物组及其微滴式数字PCR试剂盒

说明书

本发明公开了一种检测粪便中人巨细胞病毒的PCR引物组及其微滴式数字PCR试剂盒。本发明基于人巨细胞病毒保守的AD169基因组中编码即刻早期转录调节蛋白的基因序列设计特异性引物及MGB水解探针，从而得到微滴式数字PCR试剂盒，本发明通过提取粪便上清游离DNA和微滴式数字PCR试剂盒检测粪便中人巨细胞病毒的拷贝数，对辅助临床诊断患者是否患有CMV肠炎的疾病有重要指导意义。

技术领域

本发明涉及病毒核酸检测领域，具体涉及一种检测粪便中人巨细胞病毒的PCR引物组及其微滴式数字PCR试剂盒。

背景技术

异基因造血干细胞移植是多种血液系统疾病的重要治疗方式，移植后的患者经常会出现胃肠道症状，最有可能由急性移植物抗宿主反应和CMV肠炎引起，作为异基因造血干细胞移植术后的两种常见严重并发症，难以鉴别诊断，而针对两种不同的并发症临床采取的治疗方式截然不同，明确诊断并采取积极治疗措施与异基因造血干细胞移植的成功与否密切相关。

目前，CMV肠炎诊断包括以下方法：

1.CMV肠炎诊断的金标准是肠镜下肠黏膜活检病理检查，此项有创操作加重了异基因造血干细胞移植术患者的痛苦，取材部位局限，无法重复多次取样，无法动态观察病毒拷贝数的变化，并可能带来肠出血、肠穿孔的风险，极大影响患者的治疗与预后。

2.非侵入性方法，例如通过异基因移植术后患者的粪便标本的荧光定量PCR反应检测CMV核酸被认为是肠道活检的潜在替代品，有研究表明，基于粪便的PCR检测在CMV肠炎的诊断或至少排除它方面非常有价值。也有其他研究表明，在粪便中检测CMV 是CMV肠炎不够合格的诊断方式。

值得注意的是，DNA提取程序可能对粪便样本中的CMV检测产生关键影响。

1.首先，粪便标本是一种相当复杂的混合物，其中胆盐等成分可能通过干预中间许多步骤，包括DNA纯化和PCR反应，降低 DNA提取效率和PCR扩增效率来干预许多中间步骤。

2.其次，DNA提取程序决定了产物的主要DNA类型是基因组DNA还是游离DNA，这对于CMV DNA检测的差异尚未得到充分考虑。

3.最后，常规的核酸定量检测技术是荧光定量PCR检测，依赖标准曲线，敏感度有限，容易产生非特异性荧光信号。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种检测粪便中人巨细胞病毒的PCR引物组及其微滴式数字PCR试剂盒；本发明基于人巨细胞病毒保守的AD169基因组中编码即刻早期转录调节蛋白的基因(IE1)序列设计特异性引物及MGB水解探针，从而得到微滴式数字PCR试剂盒，本发明通过提取粪便上清游离 DNA和微滴式数字PCR试剂盒检测粪便中人巨细胞病毒的拷贝数，对辅助临床诊断患者是否患有CMV肠炎的疾病有重要指导意义。

为实现上述目的，本发明设计一种检测粪便中人巨细胞病毒的 PCR引物组，所述PCR引物组由引物对CMV-FR和探针CMV-P1 组成，其中，

所述引物对CMV-FR为

上游引物CMV-F1：

5’-GTGATCCATGTGCTTATGACTTTGT-3’，

下游引物CMV-R1：5’-GCCTTGGTCACGGGTGTCT-3’；

所述探针CMV-P1：5’-ATCATGTGTTTAGGCCC-3’，且探针 CMV-P1的5’端标记有荧光基团，其3’端标记有非荧光淬灭基团。

进一步地，所述荧光基团为FAM，所述非荧光淬灭基团为 MGB。

本发明还提供了一种检测粪便中人巨细胞病毒的微滴式数字 PCR试剂盒，所述PCR试剂盒包括权利要求1所述PCR引物组。