[发明专利]本氏烟MTA基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法

权利要求书

1.本氏烟MTA基因在调控植物抗病毒中的应用，其特征在于：所述病毒为凤果花叶病毒，Pepino mosaic virus，PepMV；所述MTA基因的转录本序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述本氏烟MTA基因在调控植物抗病毒中的应用，其特征在于：通过农杆菌转化的方法，将MTA基因导入目的植物中，获得的本氏烟MTA高表达植株能够显著减轻凤果花叶病毒的侵染。

3.一种抗凤果花叶病毒的MTA转基因植物的培育方法，其特征在于：通过农杆菌转化的方法，将MTA基因导入目的植物中，获得本氏烟MTA基因高表达植物，所述MTA基因的转录本序列如SEQ ID NO:1所示。

4.根据权利要求3所述的MTA转基因植物的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)本氏烟草叶片取样，使用Trizol法抽提RNA，使用oligo(dT)₁₈引物，反转录获得cDNA；

(2)使用引物对NbMTA-F与NbMTA-R，以cDNA为模板进行PCR扩增，克隆得到NbMTA；

(3)将NbMTA构建到带有GFP荧光标签的载体上，获得GFP-NbMTA重组质粒；

(4)将1μl重组质粒与100μl农杆菌感受态混合转入电击杯中，使用电击装置2500V电击转化，恢复后涂布到抗性培养基上筛选获得带有GFP-NbMTA重组质粒的农杆菌；

(5)将带有重组质粒的农杆菌侵染烟草叶片，经分化培养获得愈伤组织，再经生根培养获得小苗，转移继续培养；

(6)继续培养的小苗生长稳定后，取叶片样品，使用Trizol法抽提RNA，反转录获得cDNA；利用引物对q-NbMTA-F与q-NbMTA-R，以cDNA为模板进行RT-qPCR扩增，检测植物中NbMTA的表达水平；

取少许叶片组织，放到激光共聚焦显微镜下观察，检测是否能收集到绿色荧光信号；以上样品抽提总蛋白，进行SDS-PAGE凝胶电泳，再使用GFP抗体进行Western blot确定植物表达了带GFP荧光标签的GFP-NbMTA，对以上阳性植株留种。

5.根据权利要求4所述的MTA转基因植物的培育方法，其特征在于：所述oligo(dT)₁₈引物序列为5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'，如SEQ ID NO:6所示。

6.根据权利要求5所述的MTA转基因植物的培育方法，其特征在于：所述NbMTA-F与NbMTA-R的序列如SEQ ID NO:2-3所示；

NbMTA-F：ATGCCAACTTTGTACAAAAAAGC；

NbMTA-R：TGCAAGGGCTGGATGGCAAATAATG。

7.根据权利要求6所述的MTA转基因植物的培育方法，其特征在于：所述q-NbMTA-F与q-NbMTA-R的序列如SEQ ID NO:4-5所示；

q-NbMTA-F：CAGTGTGTTTGTTAGAGAGAGTGCC；

q-NbMTA-R：TTCAGCAGCCGTATGCG。