[发明专利]二倍体马铃薯CIP149高效离体再生体系及茎段遗传转化体系的构建

说明书

本发明公开了一种二倍体马铃薯CI P149高效离体再生体系及茎段遗传转化体系的构建，步骤如下：1)马铃薯材料CI P149的茎尖在MS30基础培养基上培养；取无生长点的茎段为外植体平铺在P‑MS20平板培养基上预培养；2)活化根癌农杆菌GV3101阳性转化菌株，摇菌至OD约0.5，用液体MS20悬浮菌体后，加入AS，弃菌液，放置于灭菌滤纸上吸干菌液，然后平铺在C‑MS20平板培养基上培养；3)经两天共培养的外植体均匀更换至培养基上进行诱导愈伤处理；4)外植体均匀更换至愈伤诱导培养基CI M上进行诱芽处理2周，之后每2周更换一次新的芽诱导培养基SI M直至出芽。本发明构建的二倍体马铃薯CI P149的遗传转化体系，得到的愈伤组织致密，颜色深绿，分化出芽仅需2个月至2个半月，且转化效率高。

技术领域

本发明涉及遗传转化技术领域，尤其涉及一种二倍体马铃薯CIP149高效离体再生体系及茎段遗传转化体系的构建。

背景技术

遗传转化技术是指通过生物、化学和物理等方法将目的基因导入受体植物基因组，并获得目的基因稳定遗传和表达的遗传改良技术，是进行分子育种和基因功能分析的重要手段。植物基因转化的成功依赖于一个良好的转化系统，能有效地将外源基因导入受体细胞，并得以表达。通过农杆菌介导的马铃薯遗传转化体系主要受基因型、预培养、菌液浓度及侵染时间、共培养等因素的影响，由于转化受体的异质性，有必要根据实际情况进行验证和改进，以获得最适转化条件。

二倍体马铃薯的优点：二倍体马铃薯占马铃薯总资源74％，其分布较马铃薯普通栽培种更为广泛，并含有多种对病、虫和不良环境的抗性基因及优良品质性状基因；同时二倍体马铃薯染色体数较少，遗传简单，易于分析和进行遗传操作。发掘二倍体马铃薯资源优良基因对于解决普通栽培种(2n＝4x＝48)遗传背景狭窄、基因库贫乏及有效改良现有普通栽培种等具有重要意义。马铃薯普通栽培种是同源或部分同源四倍体倍性水平和胚乳平衡数(EBN)的差异使其难以与二倍体马铃薯进行有性杂交，在一定程度上限制了二倍体种质资源在作物性状改良上的应用。因此构建高效的二倍体马铃薯组培再生体系，利用遗传转化的方法对于二倍体马铃薯在作物改良及植物基因工程中的应用至关重要。

当前成熟的马铃薯遗传转化体系大多是基于四倍体材料开发出来的，例如底西瑞等。二倍体马铃薯材料与四倍体存在明显的基因型差异，现有的遗传转化体系很难适用二倍体材料。因此很有必要开发针对特定二倍体材料的遗传转化体系。

发明内容

针对现有技术中存在的上述不足，本发明提供了一种二倍体马铃薯CIP149高效离体再生体系及茎段遗传转化体系的构建，该体系的构建具有转化效率高，操作简便等优点，对于二倍体马铃薯的育种实践及科学研究具有重要意义。

为了解决上述技术问题，本发明采用了如下技术方案：

二倍体马铃薯CIP149高效离体再生体系及茎段遗传转化体系的构建，步骤如下：

1)无菌保存的供体马铃薯材料CIP149的茎尖在MS30基础培养基上培养，培养温度为23±2℃，湿度为30％-40％，光照强度2000-2500lx，16h光照8h黑暗交替培养；取无生长点的茎段为外植体平铺在P-MS20平板培养基上预培养2天，每个培养皿100个外植体；

2)活化根癌农杆菌GV3101阳性转化菌株，摇菌至OD约0.5，用液体MS20悬浮菌体后，加入AS，浸染上所述预培养的外植体10min，弃菌液，放置于灭菌滤纸上吸干菌液，然后将外植体平铺在C-MS20平板培养基上28℃培养箱黑暗共培养2天，给农杆菌提供一个适宜的生长环境且能更容易的侵染茎段；

3)经两天共培养的外植体均匀更换至培养基上进行诱导愈伤处理，每个皿放置20个茎段，茎段不能放多，切好的茎段在培养基生长过程中会分泌毒素来保护自身不受伤害，茎段放的太多挨的太近毒素会影响茎段的生长；

4)经2周第3步处理的外植体均匀更换至愈伤诱导培养基SIM上进行诱芽处理，之后每2周更换一次新的SIM培养基直至出芽。