[发明专利]一种基于磷酸盐柱[5]芳烃测定T4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法

权利要求书

1.一种基于磷酸盐柱[5]芳烃和亚甲基蓝主体和客体识别作用测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)设计DNA寡核苷酸序列：所述的DNA底物链具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；

(2)合成磷酸盐柱[5]芳烃：以1,4-二(2-羟基乙氧基)苯为原料，采用艾伯佐夫反应和麦肯纳反应合成磷酸盐柱[5]芳烃；

(3)构建电化学生物传感器：DNA底物链通过形成金-硫键固定在金电极表面，MCH封闭，当存在ATP和T4 PNK时，DNA底物链末端羟基被磷酸化，以TiO₂纳米粒子作为介导，将磷酸盐柱[5]芳烃连接到电极表面，磷酸盐柱[5]芳烃与亚甲基蓝通过主体和客体识别作用发生络合，实现电化学响应信号放大；

(4)测定T4多核苷酸激酶活性：使用电化学工作站以三电极体系进行测试，采用微分脉冲伏安法DPV进行定量，绘制DPV峰电流与T4 PNK活性关系的标准曲线；

(5)测定T4多核苷酸激酶抑制剂；所述的T4多核苷酸激酶抑制剂为(NH₄)₂SO₄和NaH₂PO₄；

(6)实际样品测定：所述的实际样品为HeLa细胞。

2.根据权利要求1所述的基于磷酸盐柱[5]芳烃和亚甲基蓝主体和客体识别作用测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法，其特征在于：在步骤(2)中，磷酸盐柱[5]芳烃合成：称取10g化合物1(1,4-二(2-羟基乙氧基)苯)和32g三苯基膦放入烧杯中，加入200mL乙腈，氮气保护下逐滴加入四溴化碳溶液(40g四溴化碳溶于50mL乙腈)，室温下反应时间为5-6h，注入冰水后，得到白色晶体，晶体过滤后用石油醚/甲醇溶液洗涤，所述的石油醚与甲醇溶液的体积比为1:1，制得化合物2；称取1.6g化合物2和0.4g多聚甲醛放入烧杯中，加入20mL1,2-二氯乙烷，氮气保护下逐滴加入0.6mL三氟化硼乙醚溶液，室温下反应时间为6-7h，加水淬灭，用饱和食盐水萃取，收集下层有机相，有机相经无水硫酸钠干燥、减压浓缩、柱层析纯化，所述的石油醚与二氯甲烷的体积比为1:1，得到化合物3；称取2.5g化合物3和25g亚磷酸三乙酯放入烧瓶中，氮气保护下165℃搅拌，搅拌时间为70-80h，减压浓缩，柱层析纯化，所述的甲醇与乙酸乙酯的体积比为1:2，得到化合物4；称取3g化合物4溶于50mL二氯甲烷，0℃和氮气保护下，加入14g三甲基溴硅烷，室温下搅拌，搅拌时间为70-80h，减压蒸馏纯化后，加入30mL水搅拌，搅拌时间为0.5-1h，浓缩干燥得到固体，固体用丙酮洗涤后得到化合物5；称取0.5g化合物5溶于200mL 30％氨水，室温下搅拌，搅拌时间为70-80h，旋转干燥，得到最终产物磷酸盐柱[5]芳烃。

3.根据权利要求1所述的基于磷酸盐柱[5]芳烃和亚甲基蓝主体和客体识别作用测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法，其特征在于：在步骤(3)中，在预处理好的金电极表面滴涂5μL 1μM DNA底物链溶液，30℃下孵育2h，在1mM MCH溶液中孵育15min，PBS缓冲液冲洗；之后电极在DNA反应缓冲液中，37℃下磷酸化反应1h，PBS缓冲液冲洗；电极表面滴涂5μL 1mg/mLTiO₂纳米粒子溶液，室温下反应时间为30min，继续滴涂5μL 0.1mM磷酸盐柱[5]芳烃溶液，室温下反应时间为1h，PBS缓冲液冲洗；最后在电极表面滴涂5μL 0.4mM亚甲基蓝溶液，PBS缓冲液冲洗，制得T4 PNK电化学传感器。

4.根据权利要求1所述的基于磷酸盐柱[5]芳烃和亚甲基蓝主体和客体识别作用测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述的DNA底物链的长度为21个碱基，5′端标记羟基，3′端标记巯基；在步骤(3)中，所述的TiO₂纳米粒子的直径为40nm。

5.根据权利要求3所述的基于磷酸盐柱[5]芳烃和亚甲基蓝主体和客体识别作用测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述的DNA反应缓冲液为含1mMATP和不同浓度T4 PNK；所述的主体为磷酸盐柱[5]芳烃，客体为亚甲基蓝，介导为二氧化钛纳米粒子。