[发明专利]一种基于磷酸盐柱[5]芳烃测定T4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法

说明书

本发明公开了一种基于磷酸盐柱[5]芳烃测定T4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法，包括如下步骤：以磷酸盐柱[5]芳烃PP5作为主体，亚甲基蓝MB作为客体分子，利用二氧化钛TiO₂的介导作用，构建了一种电化学生物传感器用于T4PNK活性检测；设计的DNA底物链通过形成金‑硫键固定在金电极表面，当存在ATP和T4PNK时，DNA底物链末端‑OH被磷酸化‑PO₄，以TiO₂纳米粒子作为介导，将磷酸盐柱[5]芳烃连接到电极表面，磷酸盐柱[5]芳烃与亚甲基蓝通过主体和客体识别作用发生络合，实现电化学响应信号放大；产生的电化学信号与T4PNK浓度成正比，实现对T4PNK的高灵敏度和高选择性测定。

技术领域

本发明涉及生化分析技术领域，具体涉及一种基于磷酸盐柱[5]芳烃和亚甲基蓝主体和客体识别作用测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法。

背景技术

T4多聚核苷酸激酶(T4 polynucleotide kinase,T4 PNK)是从感染了噬菌体T4中分离得到，简称T4激酶，具有5'激酶活性，可以催化ATP的γ位磷酸基团向单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3'磷酸基团的单核苷酸的5'羟基转移，与DNA重组、复制以及损伤修复等正常细胞活动息息相关。此外，T4 PNK还是一种重要的分子生物学工具，T4 PNK的发现和应用在一定程度上促进了分子生物学的发展。目前，T4 PNK已经成为基因工程和生物分析研究中一种不可或缺的工具酶，并且进一步用于核酸损伤修复和酶抑制剂的研究。因此，测定T4 PNK的活性在生物化学及分子生物学领域都有重要意义。

柱芳烃(pillararene)是一类结构新颖的芳香族大环化合物，具有刚性的柱状结构，是继冠醚、环糊精、杯芳烃、葫芦脲之后的第五代经典大环宿主分子，由于其特殊的化学结构以及优良的主体和客体化学性质受到超分子研究者的关注。柱芳烃具备易于修饰、刚性空腔大小可调、热稳定性高、配体作用专一、结构刚性强、高度对称等特点，与客体分子表现出独特的主体和客体识别和络合性能。柱芳烃独特的空腔结构和易于修饰合成，良好的主体和客体性能和生物兼容性，在生物医用材料、药物包载、靶向传递和可控释放等方面具有应用潜力。磷酸盐柱[5]芳烃是一种水溶性柱芳烃，具有亲水的边缘和疏水的刚性空腔，能容纳多种客体分子。亚甲基蓝(methyleneblue)是一种吩噻嗪盐，水溶液呈碱性，广泛应用于化学指示剂、染料、生物染色剂和药物等方面。亚甲基蓝可作为客体分子，与磷酸盐柱[5]芳烃主体络合，进入磷酸盐柱[5]芳烃的空腔形成包合物，产生电化学信号，构建高灵敏的电化学传感器。

测定T4 PNK活性的方法主要有放射性同位素³²P、聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影法等。这些方法普遍存在不连续、耗时耗力且操作复杂、需要高素质人员、易产生放射性污染等缺点。近年来，发展了一些新的T4 PNK活性的检测方法，例如比色分析法、荧光分析法、电化学分析法、化学发光法及荧光成像分析技术等。虽然此类方法灵敏度较高，但是操作过程繁琐，成本较高，其应用受到一定程度的限制。

目前，缺乏一种实现对T4 PNK活性的高灵敏度、高选择性、快速和定量检测的基于磷酸盐柱[5]芳烃和亚甲基蓝主体和客体识别作用测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法。

发明内容

为了克服上述现有技术中的不足之处，本发明的目的是提供一种灵敏度高选择性好的测定T4多核苷酸激酶活性的电化学生物传感方法。

为了实现上述技术目的，本发明采用的技术方案的如下：本发明的一种基于磷酸盐柱[5]芳烃和亚甲基蓝主体和客体识别作用测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)设计DNA寡核苷酸序列：所述的DNA底物链具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；

(2)合成磷酸盐柱[5]芳烃：以1,4-二(2-羟基乙氧基)苯为原料，采用艾伯佐夫反应和麦肯纳反应合成磷酸盐柱[5]芳烃；