[发明专利]一种基于细胞质线性质粒的T7表达系统及其在酵母中表达蛋白质的方法

权利要求书

1.一种基于细胞质线性质粒的T7表达系统，其特征在于，所述T7表达系统包含T7 RNA聚合酶、T7转录单元、细胞质线性质粒，所述T7转录单元由T7启动子、T7终止子和目标基因构成，所述线性质粒来自真核生物细胞。

2.根据权利要求1所述的T7表达系统，其特征在于，所述T7 RNA聚合酶的基因用于构建整合型载体，转化酵母菌株，构建基因组上携带有T7 RNA聚合酶基因的宿主菌株。

3.根据权利要求1所述的T7表达系统，其特征在于，所述T7转录单元及细胞质线性质粒的部分片段用于构建整合型载体，所述细胞质线性质粒的部分片段作为基因整合用线性质粒的同源臂。

4.根据权利要求1所述的T7表达系统，其特征在于，将权利要求3中所述的含有所述T7转录单元及所述基因整合用线性质粒的同源臂的整合型载体转化到权利要求2中所述的宿主菌株中，构建细胞质线性质粒上整合有T7转录单元的、基因组上携带有T7 RNA聚合酶基因的菌株，由此得到所述T7表达系统。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的T7表达系统，其特征在于，选取真核生物的启动子作为表达所述T7 RNA聚合酶的启动子，使用真核生物的终止子作为表达所述T7 RNA聚合酶的终止子。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的T7表达系统，其特征在于，用于构建权利要求3中所述的整合型载体的同源臂为两个，分别来自所述T7转录单元待插入位置的上游和下游。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的T7表达系统，其特征在于，权利要求3中的所述整合型载体中，用于筛选阳性转化子的标记基因由所述细胞质线性质粒自身启动子启动。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的T7表达系统，其特征在于，所述细胞质线性质粒来自酵母。

9.根据权利要求8所述的T7表达系统，其特征在于，所述细胞质线性质粒为来自乳酸克鲁维酵母的细胞质线性质粒pGKL1和pGKL2。

10.根据权利要求9所述的T7表达系统，其特征在于，所述T7转录单元在线性质粒中的插入位置为pGKL1质粒的ORF2。

11.一种基于细胞质线性质粒的T7表达系统在酵母中表达蛋白质的方法，其特征在于，所述方法使用包含T7 RNA聚合酶、T7转录单元、细胞质线性质粒的T7表达系统，其中，所述T7转录单元由T7启动子、T7终止子和目标基因构成，所述线性质粒来自真核生物细胞。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述方法包括：

1)合成所述T7 RNA聚合酶的基因序列，并将其构建到整合型载体中；

2)将1)中所述的整合型载体直接转化或线性化后转化酵母菌株，得到基因组上携带有T7 RNA聚合酶基因的宿主菌株；

3)合成两段所述细胞质线性质粒的部分序列作为两个基因整合用同源臂，合成用于筛选阳性转化子的标记基因序列，并将所述两个基因整合用同源臂和所述标记基因构建到载体中，所述标记基因位于所述两个基因整合用同源臂之间，以含有目标基因的质粒为模板扩增包含所述T7转录单元的DNA片段，回收所述包含目标基因的T7转录单元片段，将其插入带有所述两个基因整合用同源臂、所述标记基因的载体中，得到整合型载体；

4)将3)中所述的整合型载体线性化后转化2)中整合后得到的所述宿主菌株，构建所述基于细胞质线性质粒的T7表达系统；

5)使用所述T7表达系统，在所述重组酵母菌株中表达所述目标基因的蛋白。

13.根据权利要求11或12所述的方法，其特征在于，使用报告基因编码荧光素酶的基因或编码绿色荧光蛋白的基因作为所述目标基因验证所述表达系统表达所述目标基因的蛋白的能力。

14.根据权利要求11～13中任一项所述的方法，其特征在于，所述酵母菌株含有细胞质线性质粒pGKL1和pGKL2。