[发明专利]一种基于细胞质线性质粒的T7表达系统及其在酵母中表达蛋白质的方法

说明书

本发明涉及一种基于细胞质线性质粒的T7表达系统，所述T7表达系统包含T7RNA聚合酶、T7转录单元、细胞质线性质粒，所述T7转录单元由T7启动子、T7终止子和目标基因构成，该系统可用于酵母中持续、稳定、高效地表达蛋白，所述线性质粒来自真核生物细胞。

技术领域

本发明涉及一种基于细胞质线性质粒的T7表达系统，所述T7表达系统包含T7 RNA聚合酶、T7转录单元、细胞质线性质粒，该系统可用于酵母中持续、稳定、高效地表达蛋白。

背景技术

T7系统来自于大肠杆菌T7噬菌体，是一套非常强大的转录系统，该系统主要由T7RNA聚合酶和其特异性识别的由T7启动子启动转录的转录单元构成。目前在原核生物中对T7表达系统的应用已经非常成熟，但在真核生物尤其是酿酒酵母中构建能够持续、稳定、高效地表达蛋白的T7表达系统仍然受到限制，这主要是因为真核生物核转录的mRNA面临着出核的问题，其mRNA具有结构特殊性。

真核生物mRNA的5′端存在帽子结构(7-甲基鸟核苷三磷酸，m7Gppp)，3′端存在多聚腺苷酸(poly(A))尾巴。5′端帽子结构能够被核糖体小亚基识别，促使mRNA和核糖体的结合，m7Gppp结构能有效地封闭mRNA 5′末端，以保护mRNA免受5′核酸外切酶的降解，增强mRNA的稳定性，参与mRNA由细胞核向细胞质基质转运的过程。3′多聚腺苷酸尾巴除了在维持mRNA稳定性和翻译起始中发挥一定作用外，也是mRNA由细胞核进入细胞质基质所必需的元件，能够大大提高mRNA在细胞质基质中的稳定性(参见，非专利文献1)。

但是在原核生物细胞中，转录和翻译发生在同一细胞空间内，且转录和翻译过程几乎同步进行，通常并不存在转录后加工的过程。因此，来自于大肠杆菌T7噬菌体的T7表达系统，作为原核宿主来源的表达系统，其转录产物不存在5′端帽子和3′多聚腺苷酸尾巴结构，在真核细胞中难以由细胞核向细胞质基质转运，进而结合核糖体进行翻译，造成蛋白质合成受到限制。

一些RNA病毒如脑炎心肌炎病毒(EMVC)、猪瘟病毒(CSFV)等，其mRNA缺乏帽子结构，这些病毒的翻译起始依赖于其5′端非翻译区的顺式作用元件——内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site，IRES)(参见，非专利文献2)，IRES能够在一些反式作用因子的辅助下募集真核生物核糖体到mRNA分子5′非翻译区启动翻译起始。

对于真核生物，有研究者在酿酒酵母中构建了基于核基因组的T7表达系统，但由于缺乏5′端帽子结构，细胞核内大量的T7 mRNA无法进入细胞质，结合核糖体被翻译为蛋白质，故该T7表达系统并未表达出目标蛋白(参见非专利文献3)。

Gunge等人利用来源于乳酸克鲁维酵母的一对线性高拷贝双链细胞质质粒PGKL1和PGKL2，在酿酒酵母中开发了与宿主复制系统正交的核外复制系统(参见，非专利文献4)。该核外复制系统编码自己的DNA聚合酶，并通过与质粒的末端蛋白(TP蛋白)结合来起始细胞质中的pGKL1和pGKL2质粒的复制。由于细胞质中的pGKL1、pGKL2质粒与核内DNA的复制方式存在差异，细胞质与细胞核之间存在物理隔离，pGKL1、pGKL2质粒的复制不受到宿主基因组复制系统的影响。

现有技术文献：

非专利文献1：朱玉贤.现代分子生物学[M].第四版.北京:高等教育出版社,2013:96-101.

非专利文献2：卢杰,张珈敏,林美娟,曹旭,胡远扬.RNA病毒翻译调控元件——内部核糖体进入位点(IRES)[J].中国生物化学与分子生物学报,2007(07):513-518.