[发明专利]一种生产甲基酮的重组酿酒酵母及其构建方法和应用

说明书

本发明公开一种生产甲基酮的重组酿酒酵母及其构建方法与应用。本发明提供的重组菌在酿酒酵母中对β‑酮酰辅酶A硫解酶基因进行敲除或失活，或降低该基因的表达或活性，可以产生甲基酮。配合过表达内源酰基辅酶A氧化酶基因，或(3R)‑羟烷基‑辅酶A脱氢酶/2‑烯酰辅酶A水合酶2基因，或酰基辅酶A硫酯酶基因，或脂酰辅酶A转运蛋白编码基因，或外源β‑酮酸脱羧酶基因中的一种或多种，大大提高产生甲基酮的能力。进一步配合过表达外源氧化酶基因，或水合酶基因，或脱氢酶基因，或硫酯酶基因，或脱羧酶基因中的一种或多种，可进一步提高产生甲基酮的能力。本发明通过实验证明获得的重组菌具有较大实际应用价值。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种生产甲基酮的重组酿酒酵母及其构建方法与应用。

背景技术

甲基酮是一类甲基直接与羰基相连的化合物的统称，包括丙酮，2-丁酮，2-戊酮，2-己酮，2-庚酮，2-辛酮，2-壬酮，2-癸酮，2-十一烷酮，2-十二烷酮，2-十三烷酮，2-十四烷酮，2-十五烷酮，2-十六烷酮，2-十七烷酮，2-十八烷酮，2-十九烷酮，2-二十烷酮，等等。甲基酮具有多种重要的天然和商业作用，其在植物中可以充当信息素和天然杀虫剂，而商业化生产的甲基酮可作为香料，为精油提供香气，并在奶酪和其他乳制品中起到调味剂的作用，也可作为化学合成中间体或者柴油调和剂。

利用合成生物学原理，通过对脂肪酸β-氧化途径进行遗传改造，已经在多种微生物中实现了甲基酮的重组生产。2012年Goh等( Goh EB, Baidoo EE, Keasling JD,Beller HR. Engineering of bacterial methyl ketone synthesis for biofuels.Appl Environ Microbiol 2012,78(1):70-80.)在工程化的大肠杆菌DH1菌株中对β-氧化途径进行了重新设计，过表达了来源于Micrococcus luteus的酰基辅酶A氧化酶基因ACO，大肠杆菌自身编码脂肪酸氧化复合体α亚基的FadB基因以及编码天然硫酯酶的FadM基因，证明了利用葡萄糖可以生产链长为C₁₁-C₁₅的甲基酮。2013年（Müller J, MacEachran D,Burd H, Sathitsuksanoh N, Bi C, Yeh YC, Lee TS, Hillson NJ, Chhabra SR,Singer SW, Beller HR. Engineering of Ralstoniaeutropha H16 for autotrophicand heterotrophic production of methyl ketones. Appl Environ Microbiol 2013,79(14):4433-4439.），该甲基酮合成途径被引入到Ralstoniaeutropha H16菌株中，首次进行了自养型细菌以CO₂作为唯一碳源生产甲基酮的报道。2018年，Hanko等人(Hanko EKR,Denby CM, Sànchez I Nogué V, Lin W, Ramirez KJ, Singer CA, Beckham GT,Keasling JD. Engineering β-oxidation in Yarrowialipolytica for methyl ketoneproduction. MetabEng 2018, 48:52-62.)将同样的甲基酮合成途径导入解脂耶氏酵母中，使其在过氧化物酶体中表达，实现了C₁₃-C₂₃甲基酮在真菌中的重组生产。