[发明专利]PfAgo蛋白介导的B19病毒核酸检测试剂盒及检测方法

说明书

本发明属于B19病毒检测技术领域，公开了一种PfAgo蛋白介导的B19病毒核酸检测试剂盒及检测方法，检测试剂盒包括三条或单条引导PfAgo靶向B19病毒ns1基因的gDNA，其序列SEQ ID NO:1～3所示；gDNA引导PfAgo特异性切割B19病毒ns1基因片段，进而生成靶向荧光分子信标的gn‑DNA进行第二轮切割，实现对B19病毒特异性和灵敏性检测。相对于现有的B19病毒检测方法，本发明不仅检测成本低，灵敏度高且特异性强，具有重要的实际应用价值。

技术领域

本发明属于B19病毒检测技术领域，具体涉及一种PfAgo蛋白介导的B19病毒核酸检测试剂盒及检测方法。

背景技术

B19病毒属细小病毒科红细胞病毒属，是目前为止能够感染并引起人类疾病的仅有的两种细小病毒之一。作为一种重要病原，B19病毒感染不同人群能够引起如儿童传染性红斑、急性再障危象、胎儿水肿甚至死胎等疾病，同时，由于其可经输血和血液制品传播，B19病毒还与输血安全及血液制品的病毒安全性密切相关，因此，开发新的病毒检测技术具有重要应用价值。

目前，B19病毒核酸检测主要包括斑点杂交法、原位杂交法、聚合酶链反应法。近年来，随着以CRISPR/Cas9为代表的新型基因编辑技术的出现并广泛应用于病原微生物等的检测，使得传统分子诊断技术迈入了低成本、高灵敏性、高特异性的新型分子诊断阶段。作为DNA病毒，B19病毒的新型检测系统E-CRIPSR法也已成功建立，主要是基于CRISPR-Cas12a特异性切割DNA性质，其检测灵敏度达到pmol级别，这表明基于新型基因编辑酶CRISPR/Cas系统的分子诊断方法在B19病毒检测过程中具有潜在的应用前景。但是，鉴于CRISPR/Cas系统中gRNA的合成费用昂贵问题，开发新的分子诊断方法具有重要意义。

Argonaute蛋白是核酸引导的核酸内切酶，在真核生物中，该蛋白参与了RNA沉默或RNA向导的RNA切割；而在原核生物中，该蛋白可在短的DNA序列的引导下切割ssDNA或ssRNA，其中NgAgo曾经被认为是替代Cas9的新型基因编辑酶。目前，尽管基于Agos的基因编辑方法并未建立成功，但是其在体外分子诊断方面的应用仍获得了重要进展。PfAgo是一种从嗜热古生火球菌(Pyrococcus furiosus)提取出的Argonaute蛋白，可在短的DNA序列的引导下切割ssDNA或ssRNA。同时，PfAgo切割产生的短单链DNA可与apo-PfAgo蛋白结合，在同一反应体系中启动下游靶标的第二轮切割，基于该原理发明人已经建立的PfAgo介导的核酸检测(PAND)技术，可实现对人乳头瘤病毒(HPV)和SARS-CoV2的核酸检测(He R,WangL,Wang F,Li W,Liu Y,Li A,Wang Y,Mao W,Zhai C,Ma L.Pyrococcus furiosusArgonaute-mediated nucleic acid detection.Chem Commun(Camb).2019,55(88):13219-22；Wang F,Yang J,He R,Yu X,Chen S,Liu Y,Wang L,Li A,Liu L,Zhai C,MaL.PfAgo-based detection of SARS-CoV-2.Biosens Bioelectron.2021,177:112932)。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于利用PfAgo介导的核酸检测技术实现对B19病毒的检测，并建立一套高灵敏度和特异性的B19病毒的核酸检测系统。

为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：

一种检测试剂盒，包括：

引导PfAgo蛋白靶向B19病毒ns1基因的gDNA，具体为如序列SEQ ID NO:1所示的gt-B19、如序列SEQ ID NO:2所示的gf-B19以及如序列SEQ ID NO:3所示的gr-B19，或仅为如序列SEQ ID NO:2所示的gf-B19；

带有荧光基团和猝灭基团的分子信标；