[发明专利]一种采用阳离子交换层析法纯化双特异性抗体的方法

说明书

本发明涉及一种采用阳离子交换层析法纯化双特异性抗体的方法。所述方法包括：采用过载倍数为动态结合载量的3‑15倍的过载模式，在pH为4.0‑7.0，电导率为3‑17mS/cm的上样条件下将双特异性抗体溶液上样至阳离子交换层析柱，采用pH以及电导率分别与前述上样条件的pH以及电导率相同的平衡缓冲液平衡柱子，收集流穿液。所述方法具有提纯纯度高，回收率高，节约填料和工时的优点。

技术领域

本发明属于抗体纯化技术领域，尤其是涉及一种采用阳离子交换层析法纯化双特异性抗体的方法。

背景技术

双特异性抗体(BsAb，下文也称为双抗)是基因工程的重组抗体，由两个不同的结合域组成，能够结合两种不同的抗原或同一抗原的两个不同表位。与单克隆抗体一样，双特异性抗体已成为治疗各种疾病重要组成部分，其用于治疗的疾病包括但不限于癌症、自身免疫、传染病以及炎症等。双特异性抗体的作用机理，一方面，通过将一个或多个效应细胞传递到特定的靶细胞来实现免疫细胞重定位，另一方面，通过多个靶点的结合实现协同效应，阻断或激活两种不同的信号通路，在靶细胞和功能分子(细胞)之间建立一座桥梁，以刺激定向免疫反应。

自首款双抗药物Removab于2009年获批上市以来，美国国家医学图书馆官方网站上共发表了180多项双特异性抗体的临床试验，而这十年间仅四款双抗药物获批上市，可见双抗成药性难度之高。究其原因，有以下三点：一是生产制备既耗时又昂贵，它需要适当、安全和稳定的细胞系生产工艺、纯化工艺和质量分析方法来获得所需的产品。二是制备生产过程的一系列问题，包括但不限于双抗的降解，聚集，变性，碎裂和氧化等。三是需要更多的临床试验来探索最佳的给药途径和最佳剂量。

目前，国内双抗项目迎难而上，已有80多款双抗药物处于临床阶段，超过40家国内药企参与布局，预计到2024年双抗药物的国内市场将达到50亿元规模。

在抗体纯化技术领域，双特异性抗体分为不对称双抗和对称双抗。不对称双抗，如果允许随机配对，出现错误配对的产品可能占总量的90％。为了解决这一问题，已有超过20个成熟的双抗设计平台，尽量减少错误配对，方便后续纯化工艺。对称双抗，也有更高的聚集倾向，在生产制备中会出现超过50％的聚集体的情况。达石药业(广东)有限公司设计的双抗为对称性双抗，亲和后纯度在85-91％之间。亲和纯化后续步骤为离子交换纯化，离子交换的动态载量(动态结合载量)跟流速相关，流速越大，填料能吸附的双抗量越少，动态载量越小。大部分阳离子介质填料的动态结合载量都不超过60mg/ml。而专利(CN104208719A，CN109336970A)，提出采用阳离子交换层析纯化过程中过载模式，能有效提高在单抗和抗体偶联小分子药物(ADC)纯度，并且指出过载上样模式的工作原理为：在阳离子交换层析模式下，多聚体比二聚体与填料的结合能力更强，所以在持续上样过程中，多聚体会把二聚体的结合位点取代，直到柱子的完全被多聚体占据，使流穿出来的样品以二聚体为主。

综合以上信息，不管是在早期研究阶段还是生产阶段，对生产产品的均一性要求都需要高纯度的样品，双抗的纯化技术显得尤为重要。

发明内容

本发明的技术目的是提供一种高效纯化双特异性抗体的方法。

一方面，本发明提供一种采用阳离子交换层析法纯化双特异性抗体的方法，所述方法包括：

采用过载倍数为动态结合载量的3-15倍的过载模式，在pH为4.0-7.0，电导率为3-17mS/cm的上样条件下将双特异性抗体溶液上样至阳离子交换层析柱，采用pH以及电导率分别与前述上样条件的pH以及电导率相同的平衡缓冲液平衡柱子，收集流穿液。

在具体实施方式中，所述双特异性抗体为对称性双特异性抗体，优选地，所述对称性双特异性抗体具有9％-10％的杂质含量，优选地，所述对称性双特异性抗体为抗HER2/抗PD-L1双功能抗体。