[发明专利]一种基于磁分离和金酶免疫复合物检测TeA含量的方法

权利要求书

1.一种基于磁分离和金酶免疫复合物检测TeA含量的方法，其特征在于，基于金纳米表面同时负载辣根过氧化物酶（HRP）和抗TeA抗体构建金粒子-抗体/HRP纳米复合物，即金酶免疫复合物；将TeA包被原（半抗原-OVA）通过EDC/NHS方法固定于羧基化纳米磁珠表面，构建功能化磁纳米粒子探针并包被于酶标孔内，其上的半抗原-OVA与样品中的TeA直接竞争结合金酶免疫复合物表面的抗TeA抗体；利用底物显色反应检测吸光值变化来定量分析样品中TeA含量。

2.根据权利要求1所述基于磁分离和金酶免疫复合物检测TeA含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、制备磁纳米粒子探针：用半抗原-OVA修饰的磁纳米粒子复合物，采用羧基化磁纳米粒子，通过EDC/NHS法活化磁纳米粒子表面的羧基后，加入半抗原-OVA溶液，磁分离纯化得到包被原功能化磁纳米粒子；

S2、制备金酶免疫复合物：采用柠檬酸钠法制备金纳米粒子，然后调节pH、优化反应摩尔比，利用静电自组装将抗TeA抗体和HRP标记在金纳米粒子表面;

S3、检测方法：将S1制备的功能化磁纳米粒子包被于酶标孔中，磁分离去上清；封闭酶标孔中未结合位点；将S2制备的金酶免疫复合物和不同浓度TeA标准品加入到酶标孔中，磁分离去除上清；加入底物反应液显色，最后加入终止液终止反应；

S4、建立标准曲线：在Origin 8.5软件中，以不同TeA标准品浓度的对数值为横坐标，以抑制率B/B₀为纵坐标（B：不同浓度的TeA标准品对应的OD_450nm值；B₀：TeA标准品浓度为0 ng/mL所对应的OD_450nm值），通过四参数回归方程拟合曲线，建立标准曲线；

S5、样品分析：将待测果蔬样品提取液代替TeA标准品溶液，按照上述步骤S3所述方法进行检测，并按步骤S4进行数据分析，计算果蔬样品中TeA含量。

3.根据权利要求2所述基于磁分离和金酶免疫复合物检测TeA含量的方法，其特征在于，所述S2制备金酶免疫复合物时，抗TeA抗体和HRP的反应摩尔比为1:10。

4.根据权利要求2所述基于磁分离和金酶免疫复合物检测TeA含量的方法，其特征在于，所述S3中，纳米磁珠表面的包被原和TeA直接竞争结合金酶免疫复合物表面的抗体：

①将S1制备得到的功能化磁纳米粒子探针分散于包被缓冲液中，取100 µL添加到酶标板孔中，磁分离弃上清；

②每孔中加入200 µL封闭液，37℃孵育1h，磁分离，用洗涤液洗涤三次；

③每孔中依次加入50 µL用标准品稀释液稀释的TeA标准品溶液和50 µL用抗体稀释液稀释后的金酶免疫复合物溶液，37℃孵育30 min，磁分离，用洗涤液洗涤三次；

④每孔中加入100 µL TMB底物显色液，37℃避光反应15 min；

⑤取出后，按50 µL/孔体积加入终止液，15min内用酶标仪测定各孔OD_450nm下的吸光值。

5.根据权利要求4所述基于磁分离和金酶免疫复合物检测TeA含量的方法，其特征在于，步骤①中，功能化磁纳米粒子探针分散后包被浓度为0.1 mg/mL。

6.根据权利要求4所述基于磁分离和金酶免疫复合物检测TeA含量的方法，其特征在于，所述包被缓冲液为0.05 mol/L、pH值9.6的碳酸盐缓冲液。

7.根据权利要求4所述基于磁分离和金酶免疫复合物检测TeA含量的方法，其特征在于，所述洗涤液为pH值为7.4，含有0.025%吐温-20、0.01 mol/L的PBS缓冲液。

8.根据权利要求4所述基于磁分离和金酶免疫复合物检测TeA含量的方法，其特征在于，所述封闭液为含有1%牛血清白蛋白（BSA）的包被缓冲液。