[发明专利]一种基于磁分离和金酶免疫复合物检测TeA含量的方法

说明书

本发明公开一种基于磁分离和金酶免疫复合物检测TeA含量的方法，基于金纳米表面同时负载辣根过氧化物酶（HRP）和抗TeA抗体构建金粒子‑抗体/HRP纳米复合物，即金酶免疫复合物；将TeA包被原（半抗原‑OVA）通过EDC/NHS方法固定于羧基化纳米磁珠表面，构建功能化磁纳米粒子探针并包被于酶标孔内，其上的半抗原‑OVA与样品中的TeA直接竞争结合金酶免疫复合物表面的抗TeA抗体；利用底物显色反应检测吸光值变化来定量分析样品中TeA含量。综合利用纳米磁珠快速分离富集目标物的优点、金纳米粒子大比表面积增加HRP负载量以及金纳米粒子的类酶活性对底物的双重催化增敏效应，建立了磁珠分离和金酶免疫复合物信号增敏检测方法，用于TeA含量的快速检测。

技术领域

本发明涉及农产品安全免疫检测技术领域，具体涉及一种基于磁分离和金酶免疫复合物检测TeA含量的方法。

背景技术

真菌毒素污染是影响农产品质量安全的关键风险因子，真菌毒素是由真菌的有毒次级代谢产物，在农产品的生产、采收、贮藏与运输等过程中均可自然发生，对人体具有强毒性，可致DNA损伤，即便在极低浓度下也可对人体健康造成危害，具有致畸、致癌、致突变等作用。细交链格孢菌酮酸（tenuazonic acid，TeA）是一种由链格孢菌产生的毒性最强、检出率最高的一种真菌毒素，已在番茄、葡萄、枸杞、柑桔、苹果等产品中普遍检出，给人体健康带来极大安全隐患。因此，在持续加大监管力度和完善监管体系的同时，加强农产品中TeA高灵敏检测技术研究十分必要。

目前TeA的检测多采用仪器分析法，包括气相色谱法、液相色谱法、液相色谱-质谱法等，这些技术在保障农产品安全中起到重要的作用，但存在一些问题，如需要昂贵的仪器设备和专业技术人员，对检材要求较高，样品前处理和提纯过程费时费力，只能在实验室进行检测，不能满足现代检测对方便、快速的要求。

酶联免疫吸附法（ELISA）操作简便，对样本要求不高，非常适合于企业自检和各级基层检测单位使用，是21世纪最有竞争力的分析方法，但是常规的ELISA方法通常需要抗原孵育，识别，洗涤等多步繁琐的步骤，检测时间较长，且需要昂贵的酶标二抗，整套方法较为费时、成本较高；同时，TeA的污染水平一般为μg/kg，对检测方法的灵敏度提出更到要求，而常规ELISA检测方法灵敏度较低，难以满足痕量TeA高灵敏、快速检测要求。

CN201611226282.2公开一种快速检测细交链格孢菌酮酸的方法，基于辣根过氧化物酶催化鲁米诺-过氧化氢发光体系，建立细交链格孢菌酮酸间接竞争化学发光酶联免疫检测方法，兼具化学发光法高灵敏度与免疫分析法特异性强的特点。但是，该方法所建立的化学发光法所需检测时间长，约15h左右，检测时间较长；同时需要用到酶标二抗、化学发光液等，所用试剂多，步骤繁琐，还需要特殊仪器化学发光免疫分析仪，基层检测单位常常不具备该仪器，实际应用中受到限制。

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种基于磁分离和金酶免疫复合物检测TeA含量的方法，解决现有细交链格孢菌酮酸检测步骤繁琐、检测时间长、灵敏度和准确度较低，成本高的问题。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是这样的：

一种基于磁分离和金酶免疫复合物检测TeA含量的方法，基于金纳米表面同时负载辣根过氧化物酶（HRP）和抗TeA抗体构建金粒子-抗体/HRP纳米复合物，即金酶免疫复合物；将TeA包被原（半抗原-OVA）通过EDC/NHS方法固定于羧基化纳米磁珠表面，构建功能化磁纳米粒子探针并包被于酶标孔内，其上的半抗原-OVA与样品中的TeA直接竞争结合金酶免疫复合物表面的抗TeA抗体；利用底物显色反应检测吸光值变化来定量分析样品中TeA含量。

进一步，具体包括以下步骤：

S1、制备磁纳米粒子探针：用半抗原-OVA修饰的磁纳米粒子复合物，采用羧基化磁纳米粒子，通过EDC/NHS法活化磁纳米粒子表面的羧基后，加入半抗原-OVA溶液，磁分离纯化得到包被原功能化磁纳米粒子；