[发明专利]一种检测粪便样本中幽门螺杆菌耐药基因突变试剂盒

说明书

本发明公开了一种检测粪便样本中幽门螺杆菌耐药基因突变试剂盒，包括检测幽门螺杆菌23S rRNA基因2142、2143位点的A2142G、A2143G突变的引物探针，检测幽门螺杆菌gyrA基因87位点的N87I、N87K突变的引物探针，检测幽门螺杆菌gyrA基因91位点的D91N、D91Y、D91G突变的引物探针，检测23S rRNA外控的引物探针，检测gyrA外控的引物探针，DNA聚合酶，幽门螺杆菌阳性质控参考品和幽门螺杆菌阴性质控参考品。本发明检测试剂盒，实现多种突变位点的检测，特异性强，检测灵敏度可达1％；非侵入性取样，减少了患者的痛苦；实际组分改进还增加了检测效果的灵敏度和特异性。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种检测粪便样本中幽门螺杆菌耐药基因突变试剂盒。

背景技术

幽门螺杆菌(Helicobacter Pylori，H.pylori)是一种革兰氏阴性菌，主要分布于胃黏膜组织中，其感染是胃炎最主要的致病因素，也是诱发胃癌的危险因素，几乎所有的Hp感染者均存在不同程度的胃黏膜炎症。全世界有超过半数的人感染HP，而在我国的感染率为59％，因此根除Hp可以减少Hp相关疾病的发生和发展。随着根治Hp标准化治疗的推广和抗菌素的广泛应用，Hp的耐药率逐年增长，Hp根治失败的几率亦随之增高。近年我国一个大规模的多中心临床研究显示，奥美拉唑、甲硝唑、克拉霉素三联7天疗程，Hp根除率仅65.9％。根治失败的原因多种多样，包括：抗菌药物的选择、患者服药的依从性、区域因素、宿主因素、PPI剂量和代谢等诸多医素。但细菌耐药仍然是最主要原因，因此如何选择抗菌素是根治Hp成功的关键。

已基本明确幽门螺杆菌对克拉霉素耐药的机制是由于幽门螺杆菌的23S rRNA基因的V区(编码肽酰转移酶区)发生点突变，核糖体构象发生改变，抑制克拉霉素和幽门螺杆菌的结合，药物不能阻止细菌蛋白合成，从而产生耐药。左氧氟沙星主要作用于DNA螺旋酶，该酶通过暂时切断DNA双链，促进DNA复制转录过程中形成的超螺旋松解，或使松弛的DNA链形成超螺旋空间构型，左氧氟沙星通过嵌入断裂DNA链中间，形成DNA-拓扑异构酶-左氧氟沙星三者复合物，阻止DNA拓扑结构变化，阻止细菌DNA复制、转录。幽门螺杆菌对左氧氟沙星药物耐药机制主要与编码DNA螺旋酶亚单位基因gyrA中左氧氟沙星药物耐药决定区(QRDR)基因突变相关。

目前，用于幽门螺杆菌耐药的方法主要有培养药敏法，一代测序法，溶解曲线法，以PCR为基数的变性高效液相色谱的方法，PCR-FISH法。培养药敏法需先进行培养，然后再进行药敏实验，步骤复杂耗时长，且不容易培养出幽门螺杆菌。一代测序法实验周期较长，对于突变频率较低的样本检出率低，只能检测10％以上的突变。PCR为基数的变性高效液相色谱的方法简单快速但只能提供样本有无突变的信息，需要结合序列分析才能得出具体的突变类型。PCR-FISH发不能确定除了克拉霉素以外其他抗生素的耐药性。以上方法都需要获得患者的胃粘膜组织，胃镜检测对患者具有侵入性，引起患者的不适。

发明内容

有鉴于此，本发明期望提供一种检测粪便样本中幽门螺杆菌耐药基因突变试剂盒，操作简单，检测效率高，灵敏度高且为非侵入性检测，不会引起患者不适。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种检测粪便样本中幽门螺杆菌耐药基因突变试剂盒，包括检测幽门螺杆菌23SrRNA基因2142、2143位点的A2142G、A2143G突变的引物探针，检测幽门螺杆菌gyrA基因87位点的N87I、N87K突变的引物探针，检测幽门螺杆菌gyrA基因91位点的D91N、D91Y、D91G突变的引物探针，检测23S rRNA外控的引物探针，检测gyrA外控的引物探针，DNA聚合酶，幽门螺杆菌阳性质控参考品和幽门螺杆菌阴性质控参考品。

这里，所述检测试剂盒以人粪作为检测模板，非侵入性取样，减少了患者的痛苦；采用扩增阻遏方法，可同时实现上述多种突变位点的检测，使用简单、快速，结果客观准确，特异性强，检测灵敏度可达1％。