[发明专利]一种羊乳外泌体的分离方法及口服液

说明书

本发明公开了一种羊乳外泌体的分离方法及口服液，该方法利用食品级柠檬酸钠解离羊乳中的酪蛋白胶束，同时使用超滤结合超速离心过程从羊乳中分离出高质量(粒径更小、纯度和浓度更高)外泌体，接着以该外泌体为原料，辅以蜂王浆、蜂蜜、氯化钠、氯化钾、焦磷酸钠、柠檬酸钠制备成羊乳外泌体口服液。本发明所提取的外泌体具有来源于天然羊乳源，且分离方法简单、高效、安全，能成功富集大量高质量羊乳外泌体，为羊乳外泌体生物功能作用的发挥和进一步应用提供了技术支持。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种羊乳高质量外泌体的分离方法，以及基于所得羊乳外泌体的口服液。

背景技术

外泌体是一类直径在30～150nm之间的膜状囊泡，通过细胞内吞作用产生。它们含有蛋白质、脂质、miRNA和mRNA等功能成分，被认为是一种从供体细胞向受体细胞输送生物活性物质的载体，在细胞内通讯、遗传信息的交换和影响免疫功能等方面发挥着重要作用。血液、尿液、唾液、腹水、羊水和乳汁等不同体液中均被证实存在。外泌体作为乳中新兴的生物活性，其功能性蛋白质和miRNA在新生儿的免疫调节中的潜在作用也被发现。乳源性外泌体作为天然的功能性物质在预防和治疗结肠炎、改善肠道菌群方面展示十分优越的性能。且乳源性外泌体可以有效地从肠道进入机体循环，其生物膜结构可与机体高效融合，作为药物的载体为静脉注射药物口服化提供可能。羊乳作为乳品市场上第二大乳源，具有营养丰富、蛋白质组成与人乳更为接近等功能特点。但目前羊乳外泌体的研究和利用还较为匮乏，基于羊乳外泌体及其相关功能性产品的开发同样具有广阔的前景。

外泌体的分离作为其研究的第一步，优良的外泌体对其后续的研究和开发至关重要。常见的外泌体的提取技术主要有超速离心法(ultracentrifugation，UC)、聚乙二醇沉淀法、超滤离心法、免疫亲和捕获法和尺寸排阻色谱法等。乳汁是一种复杂的生物学流体，含有多种蛋白质、矿物质、脂质和其他大分子物质，这对乳源外泌体的纯化构成挑战。酪蛋白作为乳汁中主要蛋白质组成，可以与磷酸钙等聚集形成胶体复合物，它们进一步合并成直经约为70～200nm的酪蛋白胶束，阻碍乳源外泌体的分离。羊乳中的酪蛋白含量高于牛乳和人乳，因此羊乳外泌体的分离更具挑战性。目前，关于羊乳外泌体制备纯化研究较少，常见的牛乳外泌体分离方法以高速离心脱脂和蛋白与UC结合两步法为主，高度依赖UC的纯化步骤，但在UC纯化过程中，部分乳蛋白会与外泌体一同沉降，无法分离。因此在羊乳外泌体产品开发过程种，需采纳一种低成本、无有害物添加且能高质量分离羊乳外泌体的方法，以保障产品的安全性。

发明内容

本发明的目的是一种高质量羊乳外泌体的分离方法，并提供一种低成本、无有害物添加的羊乳外泌体口服产品，以保障产品的安全性。

针对上述目的，本发明提供的羊乳外泌体的分离方法由下述步骤组成：

1、将鲜羊乳进行巴士灭菌后，在4℃下以4000～6000×g离心20～30min，弃去脂肪层，得到脱脂羊乳。

2、将脱脂羊乳与质量浓度为2％～5％的柠檬酸钠水溶液按体积比为1:1混合，在4℃条件下震摇孵育30～45min，获得的混合乳液在4℃下以7000～9000×g离心20～30min，弃沉淀，得到羊乳-柠檬酸钠混合乳液。

3、将所得羊乳-柠檬酸钠混合乳液依次使用0.45μm和0.22μm滤膜过滤除杂，所得滤液在4℃下以35000×g离心60～90min，取上清液在4℃下以75000×g离心60～90min，取上清液进一步在4℃下以125000×g离心60～90min，分别收集上层乳清液和羊乳外泌体沉淀。

本发明提供的羊乳外泌体口服液由下述方法制备得到：

1、将上述分离方法得到的羊乳外泌体沉淀用收集的上层乳清液轻轻吹打混匀，得到羊乳外泌体悬液。