[发明专利]一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶的热稳定性突变体及其高通量筛选方法

权利要求书

1.一种热稳定性提高的D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体，其特征在于，所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体是将如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第56，277，293位氨基酸进行突变获得。

2.根据权利要求1所述的D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体，其特征在于所述氨基酸序列的第56位组氨酸、第277位谷氨酰胺和第293位丝氨酸都突变为精氨酸。

3.如权利要求1所述的D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种编码如权利要求1-3任一项所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体的基因。

5.一种如权利要求4所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体的编码基因构建的重组载体。

6.一种如权利要求5所述重组载体转化制备的重组菌。

7.一种基于与葡萄糖异构酶相偶联用于D-阿洛酮糖3-差向异构酶热稳定性改造的高通量筛选方法，其特征在于，包括如下步骤为：

1)以D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DAE)编码基因为模板进行易错PCR，构建DAE的突变体文库；然后重组菌单菌落挑取至96深孔板中诱导表达，获得含DAE的重组大肠杆菌；

2)离心，菌体用缓冲液重悬，60℃热处理后用以催化D-果糖生成D-阿洛酮糖，催化反应一段时间后，沸水浴终止反应；将体系温度调到80℃，加入葡萄糖异构酶催化剩余D-果糖异构化生成D-葡萄糖；

3)反应至达到平衡后，加入间苯二酚显色液，沸水浴显色，冷却至室温，480nm处测定吸光值，并从中挑取吸光值增量最多的突变体进行复筛。

8.如权利要求7所述的高通量筛选方法，其特征在于，步骤2)所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶催化质量百分比为10％-30％的D-果糖异构化生成D-阿洛酮糖，葡萄糖异构酶催化剩余D-果糖异构化生成D-葡萄糖至平衡的80％以上。