[发明专利]一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶的热稳定性突变体及其高通量筛选方法

说明书

本发明公开了一种D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的热稳定性突变体及其高通量筛选方法，属于酶工程领域。该高通量筛选方法经过两轮叠加筛选获得的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶三点突变体热稳定性明显提高。该突变体与野生型相比，5min热处理的半失活温度从58.9℃升高至66.0℃，60℃热处理温度下半衰期从2.06min增加至19.52min，同时三点突变体的比酶活从野生型的214.6U/mg增加至338.5U/mg。

技术领域

本发明涉及一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶热稳定性提高的突变体及筛选热稳定性突变体的高通量筛选方法，属于酶工程领域。

背景技术

稀少糖D-阿洛酮糖(又称D-核糖-2-己酮糖)是D-果糖C3位置的差向异构体，是一种能量密度很小的单糖，其热量约为0.2kcal/g，而其甜度相当于蔗糖的70％左右。D-阿洛酮糖已被美国食品和药品管理局(FDA)确认为安全(GRAS)食品，通常用作食品工业中甜味剂或膳食补充剂。D-阿洛酮糖还具有抗氧化、控制血糖、改善胰岛素抵抗等多种生理功能，在食品工业领域具有广阔的应用前景。

D-阿洛酮糖仅存在于自然界的少数水果中，且难以通过化学合成法生产。目前主要的生产方式是酶催化法。

D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-allulose 3-epimerase，简称DAE，EC5.1.3.30)，能催化D-果糖异构化生成D-阿洛酮糖。通过比较不同来源的酶学性质，我们发现DAE普遍存在热稳定性较差的问题。

目前，分子改造技术已成功应用于改善DAE催化性能。通过合理的设计策略，包括计算机辅助△△G的计算、二硫键的设计、B因子分析、多序列比对以及亚基间作用力的分析计算，已经对来自不同来源的DAE进行了理性设计，并且在热稳定性提高效果方面取得了一定成果。

为克服在理性设计过程中改造效率较低的问题，快速高效提高DAE的稳定性，本发明利用偶联葡萄糖异构酶催化，根据检测体系酮糖与间苯二酚在酸性加热条件下得到显色的分光光度法成功构建了适合于热稳定性改造的高通量筛选方法。

Mu等对来源于Clostridium cellulolyticum H10的DAE在大肠杆菌中进行了异源表达(J.Agric.Food Chem.2011,59,14,7785–7792)。本发明以此为基础，经过两轮高通量叠加筛选，获得一个热稳定性显著提高且催化活性也更高的突变体。

发明内容

本发明内容的目的是提供一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体、编码基因、重组载体、重组菌以及用于D-阿洛酮糖3-差向异构酶催化活性改造的高通量筛选方法。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体，所述突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第56位组氨酸和第277位谷氨酰胺以及293位丝氨酸突变为精氨酸(H56R/Q277R/S293R)。

所述突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还涉及一种编码上述D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体的基因。

本发明还涉及一种携带上述D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体基因的重组载体。

本发明还涉及一种由上述重组载体转化制备的重组菌。

本发明还涉及一种基于与葡萄糖异构酶相偶联的用于D-阿洛酮糖3-差向异构酶稳定性改造的高通量筛选方法，具体步骤为：

步骤一，以DAE编码基因为模板，在0.08mM Mn²⁺下进行易错PCR，构建DAE的突变体文库，然后将重组菌单菌落挑取至96深孔板中诱导表达，获得含DAE的重组大肠杆菌。