[发明专利]人NR1D1报告基因质粒、稳转细胞株及其构建方法和应用在审
| 申请号： | 202210449409.6 | 申请日： | 2022-04-24 |
| 公开（公告）号： | CN114854792A | 公开（公告）日： | 2022-08-05 |
| 发明（设计）人： | 吴宝剑;卢丹逸;孙小雅;吴彩媚 | 申请（专利权）人： | 广州中医药大学（广州中医药研究院） |
| 主分类号： | C12N15/867 | 分类号： | C12N15/867;C12N15/113;C12N15/52;C12N5/10;C12Q1/02;C12N5/09;C12N5/077 |
| 代理公司： | 广州市华学知识产权代理有限公司 44245 | 代理人： | 张珍 |
| 地址： | 510405 广*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | nr1d1 报告 基因 质粒 细胞株 及其 构建 方法 应用 | ||
1.人NR1D1报告基因质粒的制备方法，其特征在于：将人NR1D1基因启动子序列插入至pLV6-Bmal-luc质粒中，获得人NR1D1基因启动子驱动的荧光素酶报告质粒；其中，所述的人NR1D1基因启动子序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的人NR1D1报告基因质粒的制备方法，其特征在于：
所述的人NR1D1基因启动子序列的插入位点为XhoI和BsrGI双酶切位点之间。
3.人NR1D1报告基因质粒，其特征在于：通过权利要求1中所述的制备方法得到。
4.人NR1D1报告基因稳转细胞株的制备方法，其特征在于：将权利要求3中所述的人NR1D1报告基因质粒经慢病毒包装后感染U-2OS细胞，然后采用Blasticidin S进行抗性筛选，最后通过有限稀释法获得稳定表达NR1D1-luc的单克隆细胞株。
5.根据权利要求4所述的人NR1D1报告基因稳转细胞株的制备方法，其特征在于：
所述的感染过程中病毒接种的MOI为20～40；
所述的Blasticidin S的使用浓度为3.5～4.5μg/mL。
6.人NR1D1报告基因稳转细胞株，其特征在于：通过权利要求4或5中所述的制备方法得到。
7.权利要求6中所述的人NR1D1报告基因稳转细胞株的应用，其特征在于：将所述的人NR1D1报告基因稳转细胞株接种至培养容器中，加入候选药物作用一定时间后，更换成含有荧光素酶底物的无酚红培养基，采用微孔板发光检测仪进行快速检测，通过发光值表征NR1D1基因转录活性变化，从而筛选出对NR1D1基因转录活性具有调控作用的药物。
8.一种节律细胞模型的制备方法，其特征在于：将权利要求6中所述的人NR1D1报告基因稳转细胞株接种至培养容器中，待融合度达100％后更换为节律诱导培养基继续培养，获得萤火虫荧光素酶基因表达呈周期性变化的节律细胞模型；
其中，所述的节律诱导培养基的组成如下：含0.29mg/mL L-谷氨酰胺的低糖DMEM、3.5mg/mL D-葡萄糖、0.35mg/mL碳酸氢钠、100nM地塞米松、10mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸、10％v/v FBS、100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素，pH 7.3。
9.一种节律细胞模型，其特征在于：通过权利要求8中所述的制备方法得到。
10.权利要求9中所述的节律细胞模型的应用，其特征在于：用于生物节律研究。
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