[发明专利]人NR1D1报告基因质粒、稳转细胞株及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了人NR1D1报告基因质粒、稳转细胞株及其构建方法和应用。本发明构建了一种人NR1D1基因启动子驱动的荧光素酶报告质粒，质粒经慢病毒包装后感染U‑2OS细胞，经抗生素筛选获得稳定表达NR1D1‑luc的单克隆细胞株。再者，基于所构建的NR1D1‑luc稳转细胞株，发展了一套NR1D1调节剂的高通量筛选方法，并发现了多种对NR1D1转录活性具有调控作用的小分子。此外，所构建的NR1D1‑luc细胞在地塞米松的诱导下展现出明显的节律特征，可作为一种新的节律细胞模型应用于生物节律领域相关研究。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及人NR1D1报告基因质粒、稳转细胞株及其构建方法和应用。

背景技术

核受体REV-ERBα(编码基因为NR1D1)是一种转录抑制因子，它通过招募共抑制因子NCoR和组蛋白脱乙酰酶3(HDAC3)结合到靶基因的RORE元件上，行使转录抑制功能。REV-ERBα也是分子生物钟的重要组成元件之一，这与其调控核心时钟基因Bmal1的表达有关。REV-ERBα参与调控细胞增殖、代谢和炎症等过程，在许多疾病(如失眠、代谢性疾病、炎症性疾病、心血管疾病、癌症和退行性疾病)的发生和发展过程中发挥重要作用。例如，REV-ERBα能通过直接调控NF-κB表达，抑制NLRP3炎症小体的激活和炎症反应的发生；REV-ERBα能调节肝脏和脂肪组织中参与葡萄糖和脂质代谢和转运的关键基因的表达，在调控血糖和脂质代谢及糖尿病和肥胖等代谢性疾病中发挥调控作用。因此，调节NR1D1/REV-ERBα的表达或活性是许多疾病的潜在治疗手段。

基于REV-ERBα蛋白配体结合域(LBD)与小分子的互作研究，目前研究人员已发现多种能直接与REV-ERBα蛋白结合并调节其功能的激动剂(如SR9009)和拮抗剂(如SR8278)。SR9009能有效缓解葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎、脂多糖(LPS)诱导的多器官炎症和肝缺血再灌注损伤，且对多种肿瘤细胞的增殖具有抑制作用。SR8278对高同型半胱氨酸血症、急/慢性肾病和急性心肌埂塞等疾病具有一定治疗效果。然而，这些REV-ERBα配体由于脱靶效应或药代动力学属性较差等原因，均未进入临床研究。

NR1D1是一种节律性基因，其启动子含有能被时钟因子结合的响应元件：E-box(受BMAL1/CLOCK调控)、D-box(受DBP/E4BP4调控)或RORE/RevRE(受RORs/REV-ERBs调控)。此外，肝X受体(LXR)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)和糖皮质激素受体(GR)也能调控NR1D1的表达。另一方面，一些药物的作用效果与其调控NR1D1基因的转录表达有关。例如，贝特类药物能通过PPARα受体上调NR1D1的表达，而地塞米松则通过GR抑制肝细胞中NR1D1的表达。

荧光素酶报告基因系统已被广泛用于研究目的基因的转录调控。然而，基于NR1D1基因启动子的报告系统仍未被建立。并且，目前常用的荧光素酶报告基因测定方法需要裂解细胞后再往裂解液中加入荧光素底物进行发光检测，耗时且花费较高(所使用的商品化试剂盒较为昂贵)，在大规模调节剂的筛选中应用受限。因此，构建一种NR1D1报告基因质粒和稳转细胞株，并基于稳转细胞株发展一种高通量方法应用于NR1D1调节剂的筛选，对于发现新的NR1D1调节剂并将其应用于REV-ERBα相关疾病的治疗具有重要意义。

发明内容

为解决相关问题，本发明的首要目的在于提供人NR1D1报告基因质粒。

本发明的另一目的在于提供人NR1D1报告基因稳转细胞株。

本发明的再一目的在于提供人NR1D1报告基因稳转细胞株的应用。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：