[发明专利]一种PRRSV弱病毒及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种PRRSV弱病毒，其特征在于，该PRRSV弱病毒的N蛋白中的第78位点氨基酸突变为丙氨酸。

2.权利要求1所述的PRRSV弱病毒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：构建PRRSV病毒的N蛋白的serine⁷⁸突变的反向遗传系统，使N蛋白的第78位点氨基酸突变为丙氨酸。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述构建PRRSV病毒的N蛋白的serine⁷⁸突变的反向遗传系统，包括以下步骤：

PCR扩增纯化：PRRSV病毒的全基因组序列包括目标序列和结构序列，将所述目标序列合成至载体，得到第一载体，以所述第一载体为模板，采用预定引物进行PCR扩增，得到扩增产物，电泳，回收含有突变序列的凝胶，纯化，得到突变序列；所述目标序列包括PRRSV病毒的ORF7基因；所述预定引物包括预定内切酶的引物和目标序列的引物；

突变序列与载体的连接：采用预定内切酶分别对突变序列和第一载体进行酶切，纯化回收，采用DNA连接酶进行连接，得到连接产物；

连接产物的转化和鉴定：将连接产物加入感受态细胞，转化，培养，挑取单菌落，培养，进行PCR鉴定和基因测序，得到含有突变序列的菌液；

提取阳性载体：培养含有突变序列的菌液，进行提取，得到含有突变序列的阳性载体；

构建感染性克隆载体：将结构序列和阳性载体连接，得到感染性克隆载体，所述感染性克隆载体包括具有突变序列的PRRSV病毒的全基因组序列。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述预定内切酶为XmaI限制性内切酶和BvbcI限制性内切酶。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述预定内切酶的引物序列如下所示：

XmaI-F：CACGTCGAAAGTGCCGCG(SEQ ID NO:1)

BvbcI-R：TTTTTTAATTDCGGCCGCATGG(SEQ ID NO:2)。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，将所述目标序列命名为A78，所述目标序列的引物如下所示：

ORF7-A78A-F：GGCAATTGTGTCTGTCGGCGATCCAGACTG(SEQ ID NO:3)

ORF7-A78A-R：CTGATTGAAGGCAGTCTGGATCGCCGACAG(SEQ ID NO:4)。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述PCR扩增纯化步骤中，所述PCR扩增的反应体系如下所示：

8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述PCR扩增纯化步骤中，所述PCR扩增的反应条件如下所示：

首先预变性步骤的反应温度和时间为：94℃、5min；然后变性步骤的反应温度和时间为：94℃、30s，退火步骤的反应温度和时间为：55℃、30s，延伸步骤的反应温度和时间为：72℃、30s，循环35次；最后终延伸步骤的反应温度和时间为：72℃、10min。

9.权利要求1所述的PRRSV弱病毒在PRRSV疫苗制备中的应用。